neuwiedi pauloensis & suas frações. - Purificação de uma miotoxina da peçonha de Bothrops n

A-Peçonha

Bruta

B—

NI

Cª

NZ D- N3 E- N4 F— NS G—

Nó

H—

Nõ'

!— N7 5— NS Ks— N9

Tabela 5: _{Atividade Coagulante} de

_lºng

de Peçonha Bruta e Frações, Sobre o

PlasmaBovino àTemperatura de 37ºC.

Ensaios _{Tempo de Coagulação(s)*}

VB 8,55 NI ___ NZ ___ N3 ___ N4 36,23 NS 43,33 N6 ___ N6' ___ N7 ___ N8 _--- N9 NIO

5.2.2- CromatografiaemCM—Sephadex C-ZS.

O terceiro fracionamento apresentado na figura 9 foi realizado como descrito no item 4.5.2 emostraseis picosde absorbânciaa 280nm os quais foram designados P1, P2, P3,P4, P5 e P6. Ao longo deste perfil cromatografico, a atividade fosfolipásica foi detectada

somenteno pico

Pl.

Pl

3,5

ABS

3ª

_{NH4HCO3 0,5M} _pH_8.0

280nm

_2,5

_,

P2 _ P3

ºf;

fã

NL

Í i | I I O

50

100

50

200

250 Frações 3ml/tubo

Figura 9: _{Cromatografia} em CM-SephadexC-ZS _{da Peçonha Bruta} de Bothrops

neuwiedipauloensis. Colunade 64x0,7 cm, equilibrada com o tampão bicarbonato

de amônio 0,05M pH 8,0, com fluxo de 20ml/h, coletadas frações de 3ml/tubo.

5.2.2.1- Análises Eletroforéticas.

Eletroforese emGel dePoliacrilamida Corn Agentes Desnaturantes.

A eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de agentes desnaturantes foi

realizada para averiguar o _{peso molecular dos componentes} de cada fração. Na figura 10a,

pode-se evidenciar queasfrações

Pl,

P2 e_{P6 apresentaram muitas bandas, enquanto que}as

frações P3 e P4 não apresentaram bandas. A fração PS _{apresentou uma única banda com}

baixo peso molecular em torno de lSkDa.

Eletroforese emGel dePoliacrilamida Sem _{Agentes Desnaturantes}em pH Ácido

As _{frações obtidas foram analisadas quanto} ao _grau de _{pureza. Na figura 1%, pode-se}

observar que as frações PS e P6 apresentaram bandas de maior migração eletroforética. ParaasfraçõesP3 eP4 também nãofoi _{possível detectar}bandas.

Eletroforese em Gelde_{Poliacrilamida Sem Agentes Desnaturantes} em pH Alcalino. Na figura lOc, _{pode-se observar que para} as frações P3, P4, P5 e P6 não foi _possível

97.000_,

66.000

_)

45.000———> 30.000

—>

20.100 l4.300—-—> '

Figura 10a- Eletroforese em gel de poliacrilamida com agentes desnaturantes a

14% _{da peçonha}

bruta

de Bothrops neuwiedí pauloensis e das frações obtidas no

fracionamento em gel CM-SephadexC-25. _Tampão de corrida: trizma base 0,1

M, EDTA 7,8mM, glicina 0,77M e SDS 0,3% (p/v) pH 8,3 foi utilizado como

tampão

_para

o cátodo e a mesma solução, porém sem glicina para o ânodo.

Corrente ZOmA; 200V. Tempo de corrida 60 minutos.Após terminado o _tempode

corrida, o gel foi coradocom Coomassie Brilliant Blue R250 0,1% _por 10 _minutos,

em seguida foi descorado em uma solução de ácido acético, metanol e água

(40:50:10_v/v).

1- Padrãode _{peso molecular} ( Miosina— 220kDa, FosforilaseB —97kDa, Albumina Bovina —

66kDa, Ovoalbumina—45kDa, Anidrase Carbônica — 30kDa, Inibidor de tripsina — 20.1kDa,

Figura 10b- Eletroforeseem gel de poliacrilamida sem agentes desnaturantes em

pH ácido, segundo Reisfeld (1962), da peçonha bruta de Bothrops neuwiedí pauloensis efrações obtidasem CM-SephadexC-25. Gel à 10%, tampão B-alanina

pH 4,5. 20 mA. 200V. Tempo de corrida 180 minutos. Demais condições

idênticasa figura

Na.

2- Peçonha bruta 3- PI 4- P2 5- P3 6- P4 7-PS

2345678

Figura 10c- Eletroforeseem gel de poliacrilamida sem agentes desnaturantes em

pH alcalino, segundo Laemmli (1970), da peçonha

bruta

de Bolhrops neuwíedi pauloensis e frações obtidas em CM-SephadexC-25. Gel a 10%, tampão Tris-

HCl, pH 8,3. _{20mA. 200V. Tempo de} _corrida 180 _minutos. _{Demais condições}

idênticas a figura10a. _{2- Peçonha bruta 3-}_P] 4- P2 5- P3 6- P4 7- PS

40 5.2.2.2- AtividadeFosfolipásica.

O material eluído da coluna não foi _{quantificado quanto} a concentração de proteinas9, por isso os resultados databela 6 estão sendo apresentados quanto à _{presença ou ausência} de atividade PLA2.

Tabela6: _Relação _{da Peçonha Bruta} e Frações Quanto à Presençaou Ausência de

AtividadePLA2

Amostras AtividadeFosfolipásica

VB +

Pl

+ P2 - P3 _ P4 - P5 - P6 -

- Atividade Fosfolipásica Ausente

5.2.2.3— Estudohistológico do músculo gastrocnemius direito sob ação da peçonha

bruta

de Bothrops neuwiedipauloensise sua fração.

Nos animais controles não foram observados nenhuma alteração nos tecidos do

músculo gastrocnemius (Fig. MA e 12A).Nos animais tratados com & peçonha bruta e fração PS encontrou-se alterações mais acentuadas quando injetadas a peçonha bruta e

fração PS. Estas alterações foram semelhantes: solubilização do material intracelular eosinofilico, invasão leucocitáriae resquícios de células musculares necrosadas por células fagociticas(Fig.

llB,

B e C; IZB, B e C).

)))

)

)))))))))))))))))))))))))))))))))))))) ))))

))

Figura 11: _{Fotomicrografia} de Corte longitudinal. de Sum de _espessura do músculo

gastrocnemius direitode _{camundongosapós}24horasde inoculação

Legenda: A-Controle

B- Peçonha Bruta

C—FraçãoPS

CM- Células musculares estriadas esqueléticas

I- Inflltrado Leucocitário

))))))l))))) ))))))))))))l))))))

)

43 C

Figura 12: _{Fotomicrografia} de Corte transversal. de Sum de _espessura do músculo

gastrocuemius direitodecamundongosapós 24horasde inoculação.

Legenda: A- Controle

B-Peçonha Bruta C-FraçãoPS

CM- Células musculares estriadas esqueléticas

I-Inliltrado Leucocitário

6_{_}DISCUSSÃO

Dos animais peçonhentos que acometema população humana as serpentes são _osmais

frequentes, levando a quadros clínicos sérios podendo chegar ao óbito se não tratados

(Chipaux et al., 1991).

As _{serpentes do gênero Bothrops} são bastante comuns na América do Sul _{(Chipaux et}

al., 1991), apresentando maior frequência nos acidentes ocorridos no Brasil, onde as

vítimas são atingidas principalmente nos membros inferiores (Barraviera, 1994). O

envenenamento provocado por estas serpentes pode causar hemorragia e necrose no local

da picada, podendo ser necessáriaa amputaçãodo membro afetado.

O objetivo deste trabalho foi fracionar a peçonha de _{Bothrops neuwiedí pauloensis} e

purificar a proteína miotóxica responsável pelas alterações morfológicas em músculo esquelético de camundongos. Para isso, foram realizados alguns fracionamentos a fim de

encontraras melhores condições taiscomo: tipoderesina, pH, dimensões da coluna,etc. As miotoxinasde _{peçonhas botrópicas}são proteínas básicas, dePM. entre 13 _{a 15.000,}

apresentam de 6 a 8 _{pontes dissulfeto intracadeia,} o _que lhes dão uma estabilidade muito grande em relação ao pH e temperatura e podem ou não apresentar atividade PLAZ. As PLAZ miotóxicas estão divididas em duas categorias: uma com atividade enzimática, as

miotoxinasAsp 49, e outra que não apresenta atividade enzimática, as miotoxinas Lys49,

Com base nesses dados, este trabalho teve inicio investigando-se a termoestabilidade das toxinas da peçonha de Bothrops neuwiedi pauloensis. Foi feito o aquecimento das amostras com o intuito de _precipitar e eliminar componentes que não eram de _nosso

interesse para este estudo, tais como hemorraginas e toxinas coagulantes. O aquecimento

pode desnaturare precipitar algumas proteínase com este procedimento pode-se fazer uma prévia purificaçãoa fim de separaras fosfolipases resistentesà_temperatura,

Nas eletroforeses realizadas após o tratamento da peçonha em pHs 3,5 e 7,0 e

temperatura a lOOºC ou não se observou que não houve alteração no perfil eletroforético

das amostras.

A atividade fosfolipasica em nossos experimentos foi _{analisada sempre em pH 8,0,}

emboraa enzima inicialmente tenha sido tratada em pH diferente. Os resultados mostraram que as amostras tratadas em pH 7,0 apresentaram atividade PLA2 específica da peçonha mais elevada, mas em pH 3,5 a amostra manteve cerca de 90% desta atividade, Desta forma, foi _{possível observar} _que _{as fosfolipases}são termoestáveis a IOOOC _{e o} _{pH ácido} _e

melhor queo neutro para preserva-la.

Determinadas peçonhas de _{serpentes conservam algumas toxinas hemorrágicas ativas}

depoisde _{serem expostas} a altas temperaturas, indicando assimque estas são relativamente

termoestáveis. A atividade hemorrágica obtida para a peçonha de Bothrops neuwiedí pauloensis mostrouque, quando submetidaao aquecimentoem pH7,0 o halo hemorrágico

era bem menor quando comparado ao halo da peçonhanão aquecida, indicando assim que nesta algumas toxinas hemorrágicas são termoestáveis.

O _{aquecimento também interfere com} a atividade coagulante da peçonha. Quando submetida ao aquecimento em pH 7,0 a peçonha manteve 30% da sua atividade, assim pode-se dizer que ocorreu desnaturação da maioria das toxinas coagulantes presentes na

peçonha.

O primeiro fracionamento cromatográfico em SP-SephadexC-25 da peçonha aquecida

foi resolvido em somente quatro picos de absorbânciaa 280nm designadasde

Pl

a P4 e a

46 ensaios, foi _{observada que as amostras estavam inativas, provavelmente devido} ao grande tempo em _{que foram armazenadas no freezer,} sem serem liofilizadas, por motivos de

reparos no liofilizador, Também, quando se calculou o rendimento protéico da peçonha

bruta após aquecimento observou-se que dos 100 mg de amostras pesados, após aquecimento obteve-se somente 10 _{mg de} _{proteinas dosadas para serem aplicados}à coluna.

Desta forma a peçonha foi submetida à _{nova cromatografia} de troca catiônica, mas agora

sem ser aquecida. De maneira geral a maioria das miotoxinas de peçonhas botrópicas são

proteínas de natureza básica (Soares et al., 1998), isoladas em géis trocadores catiônicos

(Moura daSilva, et

al

1991).

Assima peçonha bruta foi _{fracionada em SP-Sephadex C-25, tampão acetato}deamônio 0,05M pH 5,5, utilizando-se um gradiente contínuode concentração molar de NaCl. Foram encontrados onze picos de absorbância a 280nm, designadosN1 a N10, pode—seobservar

quea quantidadede _{picos encontrados teve aumento, podendo-se dizer que}a cromatografia

foi satisfatória, pois teve uma melhor separação de _{proteinas quando comparado} ao

fracionamento anterior.

As eletroforeses realizadas com frações obtidas nesta cromatografia serviram para acompanhareavaliaro_processodepurificação destes componentes protéicos.

Em géis de _{poliacrilamida na presença} de _{agentes desnaturantes} as frações N3 e N8

apresentaram banda única, já para as frações N1, N2 e N10 não foi possível detectar bandas, provavelmente devidoà_{pequena quantidade}de _{proteínas existentes nas mesmas.}

A fração N3 _{apresentou alto peso molecular em torno} de 66kDa e a fração N8 apresentou um componentedebaixo peso molecularem torno de 15kDa. Asdemais frações apresentaram várias bandas protéicas.

A atividade fosfolipásicafoi observada em cinco frações: N1, N4, N5, N6 eN6'.

O rendimento protéico deste fracionamento foi de 55% e a recuperação da atividade PLA2 foi de _{41,3%, sendo que} a fraçãoN1 _{representou apenas 9,5%} da _{peçonha bruta} e

Por outro lado, os ensaios “: in vivo” desta mostraram que _as atividades hemorrágicas

foram encontradas nas fraçõesNS _{apresentando várias bandas em SDS-PAGE} e fração N7

com duas bandas principais. Muitas toxinas hemorrágicasjá foram isoladas das peçonhas das serpentes da familia Viperidae. Estas toxinas são metaloproteinases dependentes de

zinco ou de cálcio _(Marsh, 1994) epodem causar hemorragia pela destruição enzimática da membrana basal, com subsequente perdada _{integridade vascular.}

Já as toxinas coagulantes foram encontradas em duas frações distintas N4 e NS, mas

apresentavam tempo de _{coagulação aproximadamente} 5 _{vezes maior que} _o da peçonha

bruta.

Para analisar a _{pureza das frações obtidas nesta cromatografia foram realizadas}

eletroforeses em condições não _{desnaturantes, mas devido} a grande quantidade de sal

existente nas amostras a resolução dos ge'is não foi satisfatória. O tampão usado nesta cromatografia não foi _{um tampão volátil, com isso no momento da liofilização} o sal se

concentra na amostra, impedindo assim uma boa resolução doperfil eletroforético.

O _{segundo método} de _{purificação testado} foi _{em gel de CM-Sephadex C-25, onde} se

obteve seis _picosde absorbânciaa 280nme aatividade fosfolipásica foi encontrada apenas

no pico

Pl.

Quando comparamos estes dois cromatogramas pudemos verificar que a

peçonha bruta fracionadaem CM-SephadexC-25 _{apresentou um menor número}de frações que em SP-SephadexC-25. No entanto, as alterações introduzidas favorecerama resolução das proteínas básicas desta peçonha (fraçõesPS e P6 em CM comparando com N9 e N10 em SP), ao mesmo tempo em que o tampão volátil foi introduzido nesta cromatografia. Sabendo ainda que as proteínas miotóxicas de _{peçonhas botrópicas} são todas de caráter básico, como amplamente relatado na literatura, consideramos que esta última cromatografia apresentou melhores resultados na purificação da miotoxina de _Bothrops

neuwiedipauloensis.

As _{eletroforeses realizadas após esta cromatografia serviram para acompanhar} o

Em géis de poliacrilamida sem agentes desnaturantes,a fraçãoPS, como pode ser visto

na figura 1% apresentou-se pura. Quando a eletroforese foi realizada na presença de

agentes desnaturantes, novamente a fração PS _{apresentou-se como banda unica} e _peso

molecular de uma fosfolipase, podendo ser uma fosfolipase, uma miotoxina ou ambos. Comofoi visto nos resultados, esta fração não possui atividade fosfolipásica, desta maneira testou-se a ação miotóxica desta fração, constatando-se assim que elae' _{uma miotoxina que}

não possui atividade fosfolipásica.

O estudo histológico evidenciou uma grande degeneração nas fibras musculares quando

o músculo esqueléticofoi submetidoàação da peçonha bruta, ocorrendo também alterações do tecido conjuntivo que apresentou aspecto de ter sido digerido. As alterações morfológicas causadas pela fração PS se assemelham quase que totalmente àquelas

causadas pela peçonha bruta em relação às fibras musculares. Mas para a peçonha bruta observou-se uma grande quantidade de hemáceas e vasos lesados, enquanto a fração miotóxica apresentou um efeito degenerativo específico sobre as células musculares, não

afetando vasos sanguíneos. A fração P5 é _{altamente lesiva para} o tecido muscular,

causando necrose celular e a presença de infiltrado leucocitário, mostrando assim uma reação inflamatória em respostaa miotoxina injetada.

7_{_}_CONCLUSÃO

O _{fracionamento} _{em CM—Sephadex C-25 foi}

bastante satisfatório, pois em uma única etapa conseguimos purificar a _{proteína miotóxica} _da _{peçonha bruta de Bothrops neuwiedi}

pauloensís.

Esta miotoxina tem somente uma _subunidade, _{é de} _{caráter básico} _e

apresentou baixo

peso molecular, em torno de _{lSKDa. Quando testada sobre substrato artificial (gema} de

ovo)a_{toxina não apresentou atividade fosfolipase}_A2.

As alterações morfológicas observadas mostraram que a _{peçonha bruta de Bot/traps}

neuwiedi_pauloensis_{e a} _fração_PS

exercem uma ação degenerativa sobreo tecido muscular estriado esqueléticodo_{músculo gastrocnemius}_de_camundongos.

s

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No documento Purificação de uma miotoxina da peçonha de Bothrops neuwiedi pauloensis (Jararaca Pintada) e sua ação sobre o músculo gastrocnemius de camundongos (páginas 43-65)