S-Nitrosotióis são potentes vasodilatadores e inibidores de agregação
plaquetárias36,37. Estas atividades e o interesse dessas moléculas como biorreguladores estão certamente associados à sua habilidade de liberação de NO38.
A reação direta da forma original do radical NO, promovendo alteração do substrato, é definida como S-nitrosilação ou nitrosação39. O NO+ e o NO- singlete reage com grupamento sulfidrila (ânion tiolato; tiol) presente em resíduos de cisteínas em proteínas, formando os compostos S-Nitrosotióis (tionitrito) através da reação de S-nitrosilação (RSH + NO → RSNO). O NO+ tem sido considerado como um importante agente nitrosante, que na ausência de um alvo apropriado (p. ex., tiol reduzido), decai para NO2- em meio aquoso. De forma predominante, o NO+ é gerado pela transferência redox entre metal de transição e o NO, e assim, metais como ferro e cobre catalisam a formação de S-Nitrosotióis40.
36 Ignarro, L. J.; Lippton, H.; Edwards, J. C.; Baricos, W. H.; Hyman, A. L.; Kadowitz, P. J.; Gruetter, C. A.; J. Pharmacol. Exp.
Ther., 218, (3), p. 739-749, 1981.
37 Butler, A. R.; Williams, D. H. L.; J. Chem. Soc. Rev., v. 22, p. 233–241, 1993. 38 Moncada, S.; Palmer, R. M. J.; Higgs, E. A.; Pharmacol. Rev., v. 43, p. 109-142, 1991.
39 Espey, M. G.; Miranda, K. M.; Thomas, D. D.; Xavier, A. S.; Citrin, D.; Vitek, M. P.; Wink, D. A.; Ann. N.Y. Acad. Sci., v. 962,
p. 195-206, 2002.
40 Wang, K.; Zhang, W.; Xian, M.; Hou, Y. C.; Chen, X. C.; Cheng, J. P.; Wang, P. G.; Curr. Med. Chem., v. 8, p. 821-834,
15 Os principais mecanismos bioquímicos formadores de S-Nitrosotióis consistem na reação direta do NO-, formação do NO+ e geração de compostos óxidos, como o N2O340. Em compartimentos intracelulares e extracelulares, os S- Nitrosotióis de proteínas, peptídeos e aminoácidos formam estoques bioativos de NO. Em sistemas biológicos, a reação do NO com grupamento tiol livre corresponde à formação de um mecanismo de transporte circulante de NO por longas distâncias41. Assim, os S-Nitrosotióis são considerados como verdadeiros
reservatórios de NO, sendo encontrados no plasma42 e em vários tecidos43. É importante ressaltar que na S-nitrosilação, a reação do NO com grupamento tiol
forma uma ligação covalente reversível. Além disso, a S-nitrosilação de grupamento de cisteína tem sido apontada como um mecanismo redox de modificação pós- translacional de alvos celulares específicos 42. A S-nitrosilação é capaz de alterar funções de diferentes proteínas, como por exemplo, de canais iônicos ligados as membranas celulares de receptores do retículo sarcoplasmático44, incluindo também fatores de transcrição e de moléculas de sinalização45.
Estudos conduzidos com detecção imunohistoquímica mostraram que a
S-nitrosilação de proteínas ocorre em diferentes tecidos, decorrente da atividade das
três isoformas de NOS. Destaca-se que a contínua atividade da iNOS acarreta a excessiva S-nitrosilação do grupamento heme da hemoglobina e centros reativos contendo tiol, causando a elevação dos níveis de S-Nitrosotióis in vivo. Foram detectados níveis de S-Nitrosotióis superiores aos valores normais, associados à expressão da iNOS, em casos de displasia broncopulmonar, pneumonia e sepse. A
41 Stamler, J. S.; Cell, v. 78, p. 931-936, 1994.
42 Gaston, B.; Reilly, J.; Drazen, J. M.; Fackler, J.; Ramdev, P.; Arnelle, D.; Mullins, M. E.; Sugarbaker, D. J.; Chee, C.; Singel,
D. J.; et al.; Proc. Natl. Acad. Sci., v. 90, 23, p. 10957-10961, 1993.
43 Nelson, E. J.; Connolly, J.; McArthur, P.; Biol Cell., v. 95, p. 3-8, 2003.
44 Krumenacker, J. S.; Hanafy, K. A.; Murad, F.; Brain Res. Bull., v. 62, 6, p. 505-515, 2004. 45 Foster, M. W.; McMahon, T. J.; Stamler, J. S.; Trends Mol. Med., v. 9, p. 160-168, 2003.
16 diminuição dos níveis de S-Nitrosotióis foi encontrada em condições patológicas como asma, fibrose cística, anormalidade perinatal e hipertensão pulmonar. Alguns dos mecanismos indutores das modificações dos níveis de S-nitrosotóis in vivo estão relacionados com alterações da formação e do metabolismo dos S-Nitrosotióis, variação da expressão dos NOS e outros mecanismos não elucidados46. Após a formação do S-nitrosotiol, o NO incorporado a este composto pode ser transferido para: i) tióis vicinais (i.e. na própria estrutura molecular); ii) tióis livres, como a L- cisteína, glutationa reduzida (GSH) e N-acetilcisteína; ou iii) centros nucleofílicos, através da reação de transnitrosilação (R1SNO + R2S → R2SNO). Em condições de estresse celular, a diminuição dos níveis de tióis reduzidos inibe a reação de transnitrosilação40.
A decomposição dos S-Nitrosotióis ocorre através de clivagem homolítica (R-SNO → RS. + NO.) e heterolítica (R-SNO → RS. + NO- e R-SNO → RS- + NO+), e como resultado, promove a liberação de NO., NO- e NO+ 47. O efeito biológico do NO tem sido especialmente atribuído à clivagem homolítica da ligação S-NO e a liberação do NO..
O NO derivado a partir das NOS, dos S-Nitrosotióis (endógenos e exógenos, abordados posteriormente) e outros doadores de NO, induz sinalização celular mediada por mecanismo dependente e independente da ligação com o complexo ferro46. Dentre as metaloproteínas reativas ao NO encontram-se a enzima guanilato ciclase, o citocromo P-450 e as próprias NOS. A reação de nitrosilação do grupamento heme da guanilato ciclase resulta na formação do complexo ferro-
46 Muller, B.; Kleschyov, A. L.; Alencar, J. L.; Vanin, A.; Stoclet, J. C.; Ann. N. Y. Acad. Sci., v. 962, p. 131-139, 2002. 47 Arnelle D. R.; Stamler J. S.; Archives of Biochemistry and Biophysics, v.318, p.279-285; 1995.
17 nitrosil e na ativação da enzima46. A guanilato ciclase ativada produz o GMPc (monofosfato cíclico de 3'-5'-guanosina), um segundo mensageiro responsável por funções regulatórias como o vasorelaxamento, a motilidade da musculatura lisa, a fototransdução e a neurotransdução na retina46.
Por sua vez, a atividade do GMPc é regulada pela atividade de fosfodiesterases que degradam este segundo mensageiro. Dados da literatura apontam a existência de duas classes de guanilato ciclase que geram GMPc, a partir da conversão do trifosfato de guanosina (GTP), as quais foram identificadas como a guanilato ciclase particulada e a guanilato ciclase solúvel48. A nitrosilação dependente de NO da guanilato ciclase pode elevar os níveis de guanilil mono fosfato cíclico (cGMP) intracelular, ativando proteínas quinases G dependentes de cGMP (PKG). Conseqüentemente, tem sido sugerido que a fosforilação de proteínas é um mecanismo através do qual a ativação da guanilato ciclase solúvel pelo NO poderia mediar à sinalização celular dependente de PKG.
O NO atua como um modulador da angiogênese49. Fatores angiogênicos induzem a liberação de NO em células endoteliais envolvidas na angiogênese. Esses processos modulados por NO incluem sobrevivência, proliferação, migração e interação com a matriz extracelular (MEC). É sabido que descontroles na via da NOS podem prejudicar a angiogênese. Além disso, em células endoteliais, NO/cGMP ativam a via de sinalização Ras-ERK1/2 MAP quinases, observando-se estímulo na atividade do receptor de EGF e da fosforilação de proteínas em resíduos de tirosina49.
48 Lucas, K. A.; Pitari, G. M.; Kazerounian, S.; Ruiz-Stewart, I.; Park J.; Schulz, S.; Chepenik, K. P.; Waldman, S. A.; Pharmacol.
Rev., v. 52, 3, p. 375-414, 2000.
18
3.3 Análise conformacional de amidas
A análise conformacional de amidas é descrita na literatura, principalmente, com a utilização de dados de RMN de 1H ou 13C.
Sabe-se que as amidas apresentam uma conjugação entre o par de elétrons não ligado do nitrogênio e a carbonila resultando, assim, em estruturas de ressonância (Figura 6 A e B). Todavia, uma terceira estrutura (Figura 6 C) foi proposta por Wiberg et. al.50 baseando-se na comparação de dados de densidade eletrônica de C, N, O em amidas planares e torcidas.
Figura 6 – Estruturas possíveis de ressonância para a carbonila amídica.
Ciente de que as estruturas B e C contribuem preferencialmente para o híbrido de ressonância de amidas, Tormena3 diz que o grupo carbonila nas amidas é melhor descrito pela estrutura dipolar C+―O-.
Estas estruturas de ressonância trazem algumas consequências como: a não equivalência magnética e geométrica dos substituintes do nitrogênio e, ainda, uma grande barreira rotacional entre a ligação C(O)―NR2.
Levando-se em conta a consequente não equivalência dos grupos ligados ao nitrogênio amídico, La Planche e Rogers51 realizaram o estudo de Ressonância
50 Wiberg. K. B.; Breneman, C. M.; Liebman, J. F. (Eds.). The Amide Linkage: Structual Significance in Chemistry.
Biochemistry and Materials Science. Wiley. New York. 2002.
19 R1 O N R2 (A) R3 (B) R1 O N R2 R3 R1 O N H R2 (A) R1 O N R2 (B) H
Confôrmero Trans Confôrmero Cis
Magnética Nuclear tendo em vista o equilíbrio entre as conformações cis/trans em amidas N,N-dissubstituídas não simétricas (onde R2 ≠ R3) em solução (Figura 7).
Figura 7 – Estrutura das amidas N, N-dissubstituídas não simétricas estudadas por La Planche e Rogers.
Os dados revelaram a predisposição de grupos volumosos ligados ao nitrogênio preferirem ocupar a posição cis ao oxigênio quando R1 = H. Já quando R1 for um grupo maior que H, e.g. alquila, esta tendência é atenuada (Figura 8). Segundo os autores, isto se deve a um efeito estérico entre os grupos alquila (ligados ao nitrogênio amídico e ao carbono carbonílico) e, portanto, uma maior atenuação na proporção do confôrmero cis ao oxigênio. Isto é evidenciado no composto N-isopropil- N-metilacetamida52,53.
Figura 8 – Proporções para os confôrmeros trans (A) e cis (B) para diversas amidas não simétricas
52 A conformação onde o grupo isopropil se apresenta cis ao oxigênio carbonílico é de 58%; Stewart, W.E.; Siddall III, T. H.;
Chem. Rev.70 (5), 517, 1970.
20 H O N Ph Et H O N Et Ph Conformação Cis 5% ConformaçãoTrans 95%
Todavia, o estudo realizado por Bourn54 relata que a proporção isomérica da
N-etil formanilida em solução apresenta 95% exo (onde o grupo fenila se apresenta trans ao oxigênio carbonílico) e 5% endo (onde o grupo fenila se apresenta cis ao
oxigênio) (Figura 9). Isto não corrobora com os dados apresentados por La Planche e Rogers51. A explicação para tal fato é proveniente de fatores que devem ser levados em consideração para se determinar a distribuição isomérica neste caso, tais como: (a) conjugação entre o grupo fenil-amida; (b) ligação de hidrogênio intramolecular entre o hidrogênio do grupo formila e a nuvem eletrônica π e (c) repulsão π-π entre o grupo fenila e o grupo carbonila. Tais efeitos, se presentes, podem estabilizar a forma exo ou trans52.
Figura 9 – Confôrmeros obtidos da N-etil formanilida nas formas exo (95%) e endo (5%).
Alguns trabalhos sobre análise de amidas utilizando-se a espectroscopia no infravermelho para a banda da carbonila são encontrados na literatura. Dentre eles
podemos citar a análise de N,N-dietilacetamidas-α-heterossubstituídas55,
N, N-dietil-α-alquiltioacetamidas-4’-substituídas56, N,N-dietil-2-feniltioacetamidas-4’-
substituídas6 e suas formas mono- (sulfóxidos correspondentes)57 e di-oxigenadas
54 Bourn, A. J. R.; Gillies, D. G.; Randall, E. W., Tetrahedron, 22. 1825, 1966. 55 Martins, M. A. P., Rittner, R., Olivato, P. R; Spectroscopy Letters, 14(7), 505, 1981. 56 Oike, F; Tese de Doutoramento,Universidade de São Paulo, Instituto de Química, 1992.
21 (sulfonas correspondente) variando os substituintes de atraentes a doadores de elétrons.
Para o caso das N, N-dietilcetamidas-α-heterossubstittuídas55
[X-CH2C(O)N(CH2CH3)2 onde X= H, OCH3, N(CH3)2, Cl, Br, SCH3, SCH2CH3, I] os autores puderam observar que a banda de CO apresentava-se como um dubleto contendo um componente de maior frequência que fora atribuído ao confôrmero cis e outro componente de menor frequência atribuído ao confôrmero gauche (Figura 10). As populações relativas aos confôrmeros cis/gauche variavam com o substituinte embora, em solventes de baixa polaridade, o confôrmero gauche seja o privilegiado populacionalmente e em solventes de alta polaridade o confôrmero preponderante é o cis. Isto é decorrente, segundo os autores, da interação orbitalar *CO / C-X (efeito hiperconjugativo), na conformação menos polar, a gauche, que a torna muito estável. Já na conformação mais polar, cis, há um efeito de campo repulsivo que a instabiliza ou não, dependendo do substituinte α-X (por exemplo, dependendo do volume do substituinte e/ou a polaridade da ligação C-X) (Figura 10).
22 No trabalho realizado por Oike56 em N, N-dietilacetamamidas-α-alquiltio substituídas e seus respectivos sulfóxidos e sulfonas [EtS(O)nCH2C(O)N(Et)2] sendo n=0, 1 e 2 respectivamente] o autor, utilizando dados de CO e cálculos de Mecânica Molecular, observou a presença de quatro confôrmeros para os sulfetos, seis confôrmeros para os sulfóxidos e quatro confôrmeros para as sulfonas.
O autor descreve que os dados de deslocamento de frequência no IV ( CO) para as amidas citadas, em relação à amida de referência [CH3C(O)N(Et)2], são sempre negativos, ou seja, a frequência do composto é sempre menor que a da amida de referência. Decorrente deste fato pôde-se determinar, através efeito do substituinte na banda de CO, que a amplitude deste deslocamento na banda de CO seguiu a ordem SOR (sulfóxido)≈SR (sulfeto) > SO2R (sulfona). Utilizando os dados acima e sabendo que para os sulfetos os quatro confôrmeros são gauche, os autores concluíram que a interação hiperconjugativa *CO / C-X é mais importante do que a interação C-X CO (Figura 11).
Os dados de UV para a série corroboraram as conclusões propostas, pois foi observado um efeito batocrômico na banda n * em relação à amida de referência (não substituída) em n-hexano e metanol. Estes dados indicaram a estabilização do orbital *CO por hiperconjugação com o orbital C-S, originando, assim, uma diminuição na energia de transição n *.
Já no caso dos sulfóxidos, ocorre o inverso sendo, então, a interação mais importante a C-X CO do que a *CO / C-X. Contudo, a somatória das duas interações deve ser da mesma ordem, decorrente do fato de que a diminuição da frequência de CO ( CO) dos sulfóxidos é da mesma ordem em comparação aos sulfetos correspondentes.
23 O C N H SR O C N H SR CO C-S * CO C-S *CO/ C-S *C-S/ CO
Figura 11 – Interações estabilizantes para os confôrmeros gauche derivados da N, N- dietilacetamidas-α-alquiltio substituída.
Decorrente do menor deslocamento da banda CO ( CO) para as sulfonas, os autores concluíram que as interações acima relacionadas para os sulfetos e sulfóxidos estariam presentes em menor intensidade nas sulfonas.
Os dados de RMN 13C concordam com os dados de IV, pois o deslocamento químico para o carbono carbonílico nas três séries estudadas apresenta, em relação ao composto de referência, um efeito e blindagem seguindo-se a ordem SO2R> SOR >SR. Os autores atribuíram esse resultado ao efeito indutivo do grupo relacionado (sulfona, sulfóxido e sulfeto).
Outro trabalho realizado por Olivato et al33 trata de N,N-dietil-α- fenilssulfinilacetamidas para-sustituídos por grupos atraentes e doadores de elétrons [Y-PhS(O)CH2C(O)N(Et)2, Y= OMe, Me, H, Cl, Br e NO2] em solventes de polaridade crescente. Nele os autores observaram, independente do solvente, uma única banda. Os dados de cálculo HF/6-31G** indicaram a presença de quatro confôrmeros: dois cis (a diferenciação dos confôrmeros cis é que uma delas apresenta as metilas do grupo N,N-dietilcarboxamido anti e outro em sin) e dois
24
gauche (novamente, a diferenciação está na orientação das metilas em sin e anti)
sendo este o mais estável.
Segundo os autores, o confôrmero cis tem maior estabilidade por apresentar uma interação Coulômbica e de transferência de carga O -
SO...C +CO e uma interação eletrostática entre O -
CO...H+orto-Ph. Já a conformação gauche apresenta uma nteração frac a ientre O-SO ...C +CO (Figura 12).
A presença de uma única banda simétrica de CO corresponde ao par de confôrmeros cis, sendo estes os mais polares e mais estáveis.
Figura 12 – Interações presentes nas conformações cis e gauche para os derivados N,N-dietil-α- fenilssulfinilacetamidas para-substituídas
Os autores descrevem que os compostos da série apresentam um abaixamento de frequência em relação ao composto de referência N,N- dietilacetamida, de 11cm-1. Isto corrobora com a proposta de que para os confôrmeros cis há uma interação Coulômbica e de transferência de carga O -SO ...C +CO e uma interação eletrostática entre O -
CO ...H +orto-Ph.
25 Por fim, a análise conformacional de N,N-dietil-α-fenilssulfonilacetamidas
para-substituídas58 no IV indicou, após o tratamento computacional de deconvolução
da banda de CO, um dubleto em solventes de baixa polaridade, sendo o componente de menor frequência o de maior intensidade e, em solventes de maior polaridade, a mesma apresentava-se com uma única banda referente ao
componente de maior frequência. Os dados de cálculo HF/6-31G** para a
N,N-dietil-α-fenilssulfonilacetamida revelaram a existência de quatro confôrmeros gauche: dois confôrmeros referentes à gauche1, referente ao ângulo OCO-CCO-C-SSO2 com valores positivos de ca. 81o, um sin e outro anti (um referente às metilas do grupo N-etilamido em anti e outro em sin) e dois gauche2, referentes ao ângulo OCO-CCO-C-SSO2 com valores negativos de ca. -65o um sin e outro anti (um referente às metilas do grupo N,N-dietilcarboxamido em anti e outro em sin). Os dados de cálculos revelaram que os confôrmeros gauche1 (sin e anti) apresentavam um momento de dipolo = 2,8D e os dois confôrmeros gauche2 um momento de dipolo
= 3,7D.
Os autores concluíram, utilizando os dados de IV e momento de dipolo, que o componente de maior frequência correspondia aos confôrmeros gauche2 e ao componente de menor frequência aos confôrmeros gauche1. Os dados de distância interatômicas para o confôrmero gauche1 indicam uma intensa interação orbitalar de transferência de carga O-SO2 ...C +CO e uma pequena interação Coulômbica entre O-SO2... C +CO. Já o confôrmero gauche2 apresenta também intensa interação orbitalar de transferência de carga O-SO2 ...C+CO e uma interação Coulômbica entre O-
SO2... C +CO. Contudo, esta interação confere ao confôrmero uma
26 proximidade entre os oxigênios carbonílico e sulfonílico, apresentando este confôrmero um Efeito de Campo Repulsivo O-
CO... O SO2 (Figura 13). Isto corrobora os dados de CO, pois este efeito aumenta a frequência da carbonila como citado anteriormente. Este fato foi ainda comprovado com o cálculo de CO onde o deslocamento de frequência para o confôrmero gauche1 é sempre discretamente negativo em relação à N, N-dietilacetamida (amida de referência) e para o confôrmero gauche2 sempre positivo relativo à mesma amida de referência. Estes dados reforçam, assim, a proposta de um efeito de transferência de carga O -SO2... C+CO no confôrmero gauche1 o qual diminui a ordem de ligação da carbonila e para de um Efeito de Campo Repulsivo para o confôrmero gauche2 que aumenta a ordem de ligação da carbonila.
27