Nocicepção induzida pela formalina

Para confirmar os resultados anteriores, foi feito o teste da formalina, que evidencia 2 fases: 0-5 mim (dor de origem central) e 15-30 mim (dor de origem inflamatória). Os resultados expressos na tabela 8 indicam que os animais que receberam tratamento oral com os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 apresentaram redução significativa do tempo de lamber a pata quando comparados ao grupo controle.

Tempo de Latência (Minutos) Compostos Dose(mg/Kg) 0 60 120 180 LPSF/NN-52 3 9,2 ±1,83 10,7±0,7 7,12 ±1,17 8,26±0,51 LPSF/NN-56 3 9,14 ± 0,65 10,66±1,75 11,28 ±01,69 10,88± 0,58* Fentanil 0,2 9,54 ± 1,72 18,1±0,6* 11,3±0,9* 8,8±1,1 Controle (salina) - 9,30 ± 0,49 9,7 ± 1,42 8,84 ± 1,31 8,58 ± 1,48

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Tabela 8: Efeito dos derivados imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPFS/NN-56 no teste de nocicepção induzida por formalina.

Grupo Dose Tempo de Lambida (s)

(media ± desvio padrão) Inibição % (mg/Kg) 0–5 min 15–30 min 0–5 min 15–30 min LPSF/NN-52 10 46,5 ± 7,4 6,65 ± 3,9* 19,5 96 LPSF/NN-56 3 38,9 ± 5,6* 22,60 ± 14,2* 32,6 87

Fentanil 0,2 4,1±0,4* 5,8±0,5* 93,0% 97%

Controle ___ 57,8±4,1 177,9±13,9 ____ ____

*p < 0,005. Significativos após análise de variância (ANOVA) de uma via seguido pelo teste de Bonferroni com intervalo de confiança de 95%, quando comparados ao grupo controle.

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8. DISCUSSÃO

Nos últimos anos, moléculas contendo os núcleos imidazolidínico e indol foram apontadas como drogas promissoras para o tratamento da inflamação e da dor (MALTA, 2005; UCHÔA et al., 2009). Neste trabalho, os derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 mostraram atividades anti-inflamatória e antinociceptiva promissoras. No testes da toxicidade aguda, utilizando uma dose de 2.000 mg/kg, não houve óbito dos animais. Os animais foram avaliados pelo método de screening hipocrático, onde foi observado ptose, piloereção e sonolência na primeira hora de observação dos animais. Não houve alteração significativa no consumo de água, alimento, peso corporal e peso dos órgãos dos animais em relação ao grupo controle. Este resultado sugere que as subtâncias em estudo possuem baixa toxicidade.

Nossos resultados estão de acordo com os estudos realizados por Malta (2005) na avaliação da toxicidade aguda de uma série de derivados imidazolidínicos 5- benzilideno-3-(4-bromo-benzil)- e 5-benzilideno-3-(4-bromo-fenacil)-2-tioxoimidazoli din-4-onas na dose de 1000 mg/kg. Os animais apresentaram alguns sinais de toxicidade, entretanto nenhum animal veio a óbito. De acordo com o Guia 423 (OECD, 2001), quando não ocorre óbito de nenhum animal ao ser administrada a dose de 2000 mg/kg, o valor da DL50 (dose suficiente para matar 50% dos animais) é dito acima de 2000 mg/kg ou entre 2000 e 5000 mg/kg, sendo considerada praticamente atóxica. O mesmo protocolo não aconselha a realização do teste de toxicidade aguda utilizando a dose de 5000 mg/kg, uma vez que é difícil a solubilização da substância e administração, protegendo assim a vida do animal. Deve-se utilizar a dose de 5000 mg/kg, caso seja necessário em um estudo para garantir a qualidade da saúde humana. Litchfield e Wilcoxon (1949) sugeriram que a DL50 para substâncias puras, seja

determinada quando a dose letal aproximada (DLA) for inferior a 2000 mg/kg.

A carragenina, agente flogístico utilizado em todos os modelos de atividade anti- inflamatória destes estudo, é um polissacarídeo sulfatado, derivado de algumas espécies de algas. Esta substância é amplamente utilizada em diversos estudos experimentais por induzir a migração de neutrófilos e por ter uma intensa ação quimiotática (SZABÓ; BECHARA; CUNHA et al., 2005). Ela desencadeia uma inflamação aguda associada à hiperalgesia envolvendo liberação sequencial de vários mediadores inflamatórios, como por exemplo a histamina, serotonina, cininas, prostaglandinas e tromboxanos (OLIVEIRA, 2002; CARVALHO, 2008; DAMAS et al., 1990). Testes realizados em

ratos comprovam que a sensibilização das articulações com carragenina aumentou a nocicepção, o edema e a resposta inflamatória celular, indicando que a esta substância ativa um mecanismo endotelinérgico (DAHER, 2004).

O experimento do bolsão de ar subcutâneo é o modelo animal que mimetiza a artrite reumatóide. Este teste é utilizado como triagem para potenciais candidatos a fármacos no tratamento da artrite. A bolsa de ar previamente inoculada no dorso do animal forma uma membrana com características semelhantes à membrana sinovial inflamada de pacientes com artrite reumatóide (SEDGWICK; LEES, 1986). Os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56, apresentaram atividade anti-inflamatória significativa neste ensaio, e esta atividade não foi dose-dependente. Com base neste resultados, sugere-se que estas substâncias podem ser potencias candidatas a fármacos anti-artríticos. A indometacina, fármaco padrão deste teste, é um anti-inflamatório não esteroidal (AINES) derivado do ácido indolacético, que inibe a atividade da enzima cicloxigenase, diminuindo também a síntese de prostaglandinas e tromboxanos a partir do ácido araquidônico (JURNAR; BRUNE, 1990). Experimentos de bolsão de ar realizados por Sayar e Melli (2005) comprovam que a indometacina é capaz de diminuir a migração leucocitária.

O teste da peritonite tem por finalidade avaliar a migração leucocitária por meio da contagem total de leucócitos que são liberados durante o processo da inflamação aguda. Esse processo ocorre após a inoculação do agente flogístico via administração intraperitoneal. Vários mediadores pró-inflamatórios estão envolvidos neste tipo de inflamação aguda, como neuropeptídeos, prostaglandinas, NO e citocinas (DE CASTRO FRANCA et al., 2007). As citocinas pró-inflamatórias atuantes neste modelo são IL-1β, IL-6, IL-8 e TNF-α (PEREIRA, MEDEIROS, FRODE, 2006). A análise dos dados neste experimento demonstra que os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 nas doses de 10mg/kg e 3mg/kg provocaram uma redução significativa na migração de leucócitos polimorfonucleares. Segundo Szabó e colaboradores (2005), dentre os modelos utilizados em estudos experimentais, a indução na migração de neutrófilos com uso de carragenina por via intraperitoneal é modelo consagrado na investigação do processo inflamatório agudo, por utilizar uma substância com intensa ação quimiotática. Sabe-se que os AINES, como a indometacina, ao inibir a síntese de prostaglandinas, que são substâncias vasodilatadoras, acarretam a redução de fluxo sanguíneo de forma a comprometer a migração de PMNL para a região da inflamação.

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A avaliação dos níveis de citocina foi realizada nos exsudatos obtidos nos testes de bolsão de ar e peritonite induzida por carragenina. Os compostos em estudo diminuíram a concentração de TNF-α e IL-1ß nos exutados inflamatórios. A IL-1ß promove a expressão de moléculas de adesão, migração de leucócitos e aumento da permeabilidade vascular, indicando que IL-1ß é um importante mediador pró- inflamatório (HALLEGUA; WEISMAN, 2002). O TNF- α é uma citocina chave para a resposta imune inata. O aumento da concentração desta citocina no organismo está vinculada a uma série de doenças auto-imunes, como a artrite reumatóide. Com base nos resultados obtidos podemos sugerir uma relação entre a diminuição da migração celular e a redução na liberação destas citocinas pró-inflamatórias. Estudos descritos por Yu et al. (2010), indicam que compostos hidantoínicos associados ao Zinco são potentes inibidores da enzima precursora do TNF- α, o que torna o núcleo imidazolidínico um alvo de pesquisa para novos anti-inflamatórios orais.

Estudos realizados por Das et al. (1998), descrevem a diferença entre os métodos de bolsão de ar e peritonite induzida por carragenina. No método do bolsão de ar, os neutrófilos são o tipo de célula em maior abundância. Estes são responsáveis pela quimiotaxia. Na peritonite induzida pela carragenina existe uma quantidade elevada de macrófagos e mastócitos. Estas células são atraídas ao local da inflamação pelas citocinas pró-inflamatórias, principalmente IL-1β e TNF-α. Os resultados deste estudo corroboram a utilização dos dois métodos distintos para avaliação da inflamação aguda; podemos inferi que os compostos em estudo inibem a produção de mediadores por neutrófilos e macrófagos, uma vez que apresentou ação nos testes do bolsão e peritonite, respectivamente.

O modelo da pleurisia induzida por carragenina e caracterizado por duas fases inflamatórias, uma aguda (4h) e uma crônica (48h), com diferentes mediadores envolvidos. Ambas as fases estão associadas a uma acentuada reação inflamatória, nas vias respiratórias, semelhante a que ocorre na asma humana (DALMARCO e FRÖDE, 2007). Estudos realizados por Frode, em 2000, comprovam que neste modelo experimental existe a participação de citocinas com efeitos pró-inflamatórios (TNF-α, IL-1β, IL-8) e anti-inflamatórios (IL-6, IL-10), com base nos resultados de que tanto anticorpos-policlonais como citocinas-recombinantes, administrados diretamente na cavidade pleural juntamente com a carragenina, reproduziram parcialmente seus efeitos pró-inflamatórios ou antiinflamatórios. O influxo de leucócitos do sangue ao local da inflamação desempenha um importante papel na modulação da resposta inflamatória

(SALEH, et. al., 1996; PENIDO, et al., 2006). Os resultados obtidos neste trabalho mostraram que os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 apresentaram efeito anti- inflamatório na fase aguda da pleurisia induzida por carragenina, inibindo a migração leucocitária. Os derivados imidazolidínicos apresentaram atividade inferior à Dexametasona, substância conhecida por seu efeito imunossupressor e fármaco padrão relatado na literatura como eficaz para este tipo de experimento como também inferiores a indometacina. (PERREIRA et al., 2006; DALMARCO, et al., 2009; FRÖDE, et al., 2009).

Com a finalidade de avaliar a ação dos derivados imidazolidínicos deste estudo na liberação de aminas vasoativas (histamina, bradicinina, serotonina) e formação de edema, utilizou-se o teste de permeabilidade vascular induzida por ácido acético. Os derivados indol-imidazolidínicos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 produziram uma significativa inibição da permeabilidade vascular. Este efeito provavelmente envolve a diminuição na liberação de aminas vasoativas, com conseqüente redução do edema. A indometacina, que também contém o núcleo indol, é eficaz em reduzir a permeabilidade vascular e liberação de aminas vasoativas.

O ácido acético age liberando mediadores endógenos que estimulam os neurônios nociceptivos. Em camundongos provoca, em nível peritoneal, um aumento nos níveis de PGE2 e PGF2á, serotonina, histamina (DERAEDT et. al., 1980), liberação de bradicinina e citocinas, como TNF-α e IL-8 (RIBEIRO et al., 2000). Deste modo provoca comportamentos estereotipados que são caracterizados por contorções abdominais, redução e incoordenação da atividade motora (LE BARS; GOZARIU; CADDEN, 2001). Os resultados indicam que os derivados indol-imidazolidínicos deste estudo reduziram significativamente o número de contorções abdominais em comparação ao grupo controle. Ambas as susbtâncias apresentaram efeito semelhante ao diclofenaco, fármaco de referência. Segundo Daher (2004) os AINES como indometacina, diclofenaco e ibuprofeno são capazes de diminuir as respostas sensoriais do sistema nociceptivo por uma ação central. Pode-se então sugerir que o mecanismo de ação dos compostos utilizados neste estudo pode estar ligado à inibição da liberação de aminas, prostaglandinas e consequentemente da cicloxigenase e inibição da liberação de citocinas pró-inflamatórias como o TNF-á e IL-1â. Malta (2005), avaliou o potencial anti-nociceptivo do derivado imidazolidínico 3-(4-bromo-fenacil)-5-(4-dimetilamina- benzilideno)-2-tioxo-imidazolidin-4-ona (LPSF/NN-165), pelo método de contorções abdominais induzidas pelo ácido acético. Os resultados indicam que a substância inibiu

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de maneira eficaz as contorções em relação ao grupo controle com percentual de inibição de 52 % na dose de 10 mg/kg.

O teste de contorções abdominais pelo ácido acético, apesar de ser um ensaio bastante utilizado para triagem de drogas analgésicas, não distingue fármacos que atuam por mecanismo central ou periférico. Para ter indícios do mecanismo de ação, foi realizado o teste da placa quente. Este teste é um modelo animal para avaliação do perfil de atuação de fármacos com atividade antinociceptiva de ação central. As respostas comportamentais exibidas pelos animais neste ensaio como lamber as patas e pular, são de nível supra-espinhal, sendo, portanto utilizado para verificação do efeito antinociceptivo central (LE BARS; GOZARIU; CADDEN, 2001; RINALDI et al., 2009).

Na avaliação da atividade antinociceptiva pelo método da placa quente, os resultados demonstram que nos tempos de análise nenhum dos derivados testados apresentou ação quando comparados ao controle. O fentanil não apresentou efeito antinociceptivo no tempo de 180 minutos após o tratamento, pelo fato de este fármaco ser um anestésico de curta duração (HONET et al., 1992). Este experimento complementa os resultados obtidos no teste das contorções abdominais induzidas por ácido acético, o que nos permitem concluir que o mecanismo de ação dos derivados testados não está relacionado à ação central, estando provavelmente relacionado com a capacidade das substâncias testadas de reduzir os níveis de TNF-α e IL-1, assim como com a provável inibição da produção de prostaglandinas.

Na indução do estimulo doloroso pela formalina se distingue duas fases, onde a primeira fase é indicativa de dor neurogênica (primeiros 5 minutos) e a segunda fase é indicativa de dor inflamatória (15 a 30 minutos) depois da administração da formalina. O composto LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 não apresentaram inibição da dor na primeira fase do teste, entretanto, na segunda fase que é indicativa de dor inflamatória, houve a inibição eficaz da dor inflamatória. Segunda García et al. (2004), os fármacos que agem na primeira fase têm ação central como os narcóticos. A inibição ocorrida na segunda fase do teste da formalina indica uma ação periférica semelhante aos AINES e os anti- inflamatórios esteroidais. Os dados obtidos neste experimento reforçam os achados no teste da placa quente, confirmando que estes compostos atuam por mecanismo periférico. Malta, em 2005, ao avaliar o potencial antinociceptivo utilizando a mesma metodologia para a substância 3-(4-bromo-fenacil)-5-(4-dimetilamina-benzilideno)-2-

tioxo-imidazolidin-4-ona (LPSF/NN-165), obteve resultados apenas na segunda fase, o que caracteriza uma ação dos derivados imidazolidínicos na dor inflamatória.

Em conjunto, os dados obtidos nos experimentos mostram que os compostos indol-imidazolidínicos testados apresentam propriedades anti-inflamatórias e antinociceptiva promissoras. A atividade anti-inflamatória foi evidenciada pela diminuição da migração celular em vários modelos experimentais, e esta diminuição provavelmente se deve a uma modulação do sistema imune, através da diminuição de TNF-α e IL-1β. O efeito antinociceptivo apresentado pelo composto parece envolver mecanismos periféricos, atuando na dor inflamatória.

9. CONCLUSÕES

De acordo com os resultados obtidos neste estudo podemos concluir que:

 Os derivados indol-imidazolidínicos em estudo apresentaram baixa toxicidade, tendo o valor da DL50 estimado em 2500 mg/kg, sendo considerada segura;

 Os compostos o LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56, apresentaram atividade anti- inflamatória frente aos experimentos de bolsão de ar subcutâneo, peritonite e pleurisia induzidos por carragenina, com redução significativa da migração leucocitária;

 Na avaliação dos níveis de citocinas, os compostos em estudo diminuíram a concentração de TNF-α e IL-1ß nos exutados inflamatórios;

 Os derivados indol-imidazolidínicos em estudo também inibiram significativamente a permeabilidade vascular induzida por ácido acético.

 Os resultados nos testes de ácido acético e placa quente indicam que os compostos LPSF/NN-52 e LPSF/NN-56 possuem atividade antinociceptiva;

 Os resultados obtidos nos testes da placa quente e formalina sugerem que os compostos em estudo atuam por mecanismos periféricos, atuando na dor inflamatória.

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