3. Progressos notáveis
3.1. O comentado esquema XVII/XIII
L’ensemble des techniques utilisées vont avoir pour but de mettre en évidence la présence du
matériel génétique (ADN ou ARN) du parasite. La mise en évidence de ce matériel génétique
passe par la reconnaissance d’une séquence cible et donc le choix de l’amorce appropriée
ainsi que l’amplification de l’ADN ou de l’ARN du trypanosome. La sensibilité et la spécificité
de ces tests sont donc intimement liées au choix de la séquence d’amorce. Cette amorce doit
donc cibler une séquence :
Julien BONNET | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2017
73
• Unique, afin de ne détecter que l’élément recherché qui dans notre cas
est le trypanosome.
• Suffisamment répétée pour que les séquences obtenues par
amplification soient en quantité détectable.
• Suffisamment conservée dans le génome du parasite au cours de son
évolution dans le but d’éviter les faux négatifs.
En fonction du choix de l’amorce il sera possible de détecter un parasite du groupe
Trypanozoon ou plus spécifiquement une sous-espèce pathogène pour l’Homme. Dans notre
cas, nous détaillerons uniquement les techniques capables de détecter T. b. gambiense.
Les outils de détection moléculaire représentent des tests très sensibles ayant l’avantage de
pouvoir être pratiqués sur des échantillons (sang et LCR) mis en réserve (sang conservé sur
papier buvard ou congelé). Toutefois, la plupart de ces tests ne sont pas adaptables au terrain
en raison de leur complexité et sont réservés aux laboratoires de référence. L’amplification
doit être précédée d’une étape de purification dans un endroit distinct (afin d’éviter les
contaminations) du matériel génétique et nécessite un appareil capable de maintenir des
cycles de chaleur. Ce sont des éléments difficiles à mettre en place sur le terrain (WHO, 2013).
De plus, les acides nucléiques peuvent être des éléments très stables dans le temps et leur
détection ne garantit pas la présence du parasite vivant au moment de l’examen. L’OMS
recommande de ne pas prendre de décision thérapeutique uniquement en fonction des
résultats de tests moléculaires, ces tests ne doivent être utilisés que pour identifier des cas
suspects (WHO, 2013).
La séquence cible de choix pour la caractérisation de T. b. gambiense est le gène TgsGP pour
Trypanosoma gambiense-specific GlycoProtein (Radwanska et al., 2002). Ce gène de 47 kDa
code pour une glycoprotéine de surface exprimée au niveau de la poche flagellaire de T. b.
gambiense Groupe 1 (Gibson et al., 2010). Ce gène est possiblement impliqué dans la
résistance du parasite au sérum humain (Berberof et al., 2001; Capewell et al., 2013).
1.7.1.3.1. Amplification d’ADN par PCR
La réaction de PCR, pour Polymerase Chain Reaction ou Réaction de Polymérisation en
Chaine, permet d’amplifier des séquences cibles d’ADN pour qu’elles puissent être identifiées.
Dans le cas de T. b. gambiense, il s’agit du gène TgsGP présent en faible nombre de copies,
qui est amplifié. Lorsqu’un faible nombre d’ADN est disponible, il est possible d’augmenter la
quantité d’ADN en amplifiant tout le génome grâce à une amplification par déplacements
Julien BONNET | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2017
74
multiples (Deborggraeve and Büscher, 2010). Un nombre important de copies de la séquence
cible est ensuite produit par une réaction enzymatique contrôlée par des cycles de chaleur
(environ 2 heures). L’amplicon est ensuite visualisé par migration sur gel d’agarose couplé à
une coloration à l’aide d’un intercalant de l’ADN (bromure d’éthidium ou Midori Green).
La PCR sur sang est un outil très performant pour le diagnostic présentant une excellente
sensibilité (99%) et spécificité (97,7%) mais est difficile à mettre en place sur le terrain en
raison de sa complexité, de son coût et de la logistique nécessaire. Cette technique est donc
réservée aux laboratoires de référence et de recherche. La PCR sur LCR est possible pour la
détermination de stade mais présente une sensibilité et une spécificité plus faible (Mugasa et
al., 2012).
Une PCR en temps réel a été développée par Becker et al en 2004 et permet d’abaisser le
seuil de détection à 100 trypanosomes par mL de sang et peut être utilisée sur du sang
conservé sur papier buvard. Ceci permet de collecter de façon simple les échantillons sur le
terrain et de réaliser un diagnostic sensible et rapide ensuite en laboratoire. Un autre dérivé
de la PCR a été développé par Deborggraeve et al en 2006, la HAT-PCR-OC pour Human
African Trypanosomiasis-PCR-OligoChromatography. C’est un test simplifié utilisant une
jauge à flux latéral pour la visualisation du produit de PCR à l’aide d’une hybridation avec une
sonde marquée à l’or. Ce test permet de visualiser un résultat de PCR en 5 minutes et présente
un seuil de détection équivalent à 1 trypanosome pour 180 µL de sang (5 fg d’ADN de T.
brucei).
Toutefois, ces deux techniques PCR utilisent une séquence cible issue de T. brucei et donc
ne permettent pas de diagnostiquer spécifiquement T. b. gambiense (Becker et al., 2004).
Elles peuvent être aussi mises en défaut (faux positifs) en cas d’infection passagère par des
trypanosomes non pathogènes.
1.7.1.3.2. Amplification d’ARN
Ce test, nommé NASBA, basé sur la détection de l’ARN ribosomique 16S commun au groupe
Trypanozoon a été le précurseur du LAMP (Notomi et al., 2000). Cette technique introduite
par Compton en 1991 permet l’amplification d’une séquence cible avec une température stable
faible (40°C), elle a été adaptée ensuite à la détection du trypanosome en 2007.
La principale faiblesse de cette technique est la faible température d’hybridation qui augmente
la probabilité d’hybridations non spécifiques et fait ainsi chuter la spécificité. Des méthodes de
NASBA en temps réel (Mugasa et al., 2008) combinées à une oligochromatographie (Mugasa
et al., 2009; Matovu et al., 2010) ont été développées. Ce test présente donc un seuil de
Julien BONNET | Thèse de doctorat | Université de Limoges | 2017