O complexo eIF4F e a PABP nos tripanosomatídeos.

A iniciação da tradução nos tripanosomatídeos ainda precisa ser mais compreendida mas, a partir da conclusão do sequenciamento dos genomas das primeiras espécies destes organismos, já foram descritos dois homólogos do fator eIF4A, quatro de eIF4E, cinco de eIF4G e três de PABP em Leishmania (Yoffe et al., 2004; Dhalia et al., 2005; Yoffe et al., 2006; da Costa Lima et al., 2010). Com exceção da PABP, que possui apenas dois homólogos encontrados em T. brucei e

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diferentes espécies de tripanosomatídeos. O número elevado de homólogos de eIF4E (são seis ao todo, com dois ainda não descritos na literatura) e eIF4G chama bastante a atenção, em especial se considerar que eucariotos bem mais complexos, como animais metazoários, tem até três homólogos de eIF4E e em geral um ou dois homólogos de eIF4G (Contreras et al., 2008). É possível que este fato seja consequência do complexo ciclo de vida destes organismos, com dois hospedeiros e formas de vida distintas (Dhalia et al., 2005), embora um outro protozoário com um ciclo de vida ainda mais complexo, como o Plasmodium falciparum, conte com apenas dois homólogos de eIF4E (Shaw et al., 2007).

2.6.1 EIF4As

O primeiro homólogo de fator de iniciação da tradução identificado em tripanosomatídeos foi um homólogo de eIF4A de Leishmania, denominado de LeIF, que é constitutivamente expresso nas suas fases amastigota e promastigota (Skeiky et al., 1998). Contudo, seu papel na iniciação da tradução só passou a ser investigado mais tarde, quando da identificação de um segundo homólogo deste fator (Dhalia et al., 2005). Em T. brucei seus ortólogos foram melhor caracterizados e observou-se que apenas um deles (o TbEIF4AI ou EIF4AI) é um eIF4A funcional com função na tradução, visto que sua localização é citoplasmática e a depleção pela técnica de RNAi causa a inviabilidade do parasita e inibição da síntese proteica. Já o segundo homólogo de eIF4A também é essencial para a célula mas possui uma localização nuclear e não parece estar envolvido na síntese proteica. Este parece ser um provável ortólogo do eIF4AIII, com quem tem mais homologia de sequência, e por este motivo foi denominado de TbEIF4AIII (ou EIF4AIII), agindo talvez em

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mecanismos de processamento dos mRNAs (Dhalia et al., 2006). Outro estudo independente confirma que a função do EIF4AI deve estar relacionada com a tradução, visto que possui função ATPase dependente de RNA in vitro e interage diretamente com o eIF4G de levedura (Barhoumi et al., 2006).

2.6.2 EIF4Gs

Em contraste com os homólogos de eIF4E e eIF4A, cuja similaridade com seus equivalentes de outros eucariotos se dá ao longo de toda a sua sequência, a semelhança entre os cinco homólogos de eIF4G de tripanosomatídeos (EIF4G1 a 5) e os de outros eucariotos se restringe a seu domínio central de ligação ao eIF4A, eIF3 e RNA. A exceção dos EIF4G3 e 4, que possuem região de homologia entre si ao longo de toda sua sequência, é apenas nesse dominío central que também ocorre homologia entre estas proteínas (Dhalia et al., 2005). Do ponto de vista funcional, até o momento apenas os EIF4G3 e 4 foram direta ou indiretamente implicados na síntese protéica. No caso do EIF4G3, este se mostrou-se capaz de interagir diretamente com o EIF4E4 e com o EIF4AI e o complexo formado foi encontrado na fração polissomal, indicando sua participação na tradução (Yoffe et al., 2009). Em T. brucei, as mesmas interações foram observadas, além de uma interação adicional entre o EIF4G3 e o EIF4E3, que parece ser específica desta espécie (Freire et al., 2010). Já no caso do EIF4G4, sua interação específica com o EIF4E3 em Leishmania e T. brucei reforça um papel na tradução, se não ativamente no processo ao menos como um elemento regulador (Freire et al., 2010; Zinoviev et al., 2012).

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2.6.3 PABPs

Os três homólogos da PABP identificados em Leishmania sp. possuem todas as regiões identificadas para as PABPs citoplasmáticas, entretanto foi observado que as três proteínas diferem na maneira de se ligar ao RNA alvo. Todas são citoplasmáticas e expressas simultaneamente, mas o tratamento com Actinomicina D leva a migração quase que total das PABP2 e 3 para o núcleo, diferentemente da PABP1. De fato, experimentos de imunoprecipitação mostram que as PABP2 e 3 interagem entre si, e nenhuma das duas se liga a PABP1, enquanto que somente a PABP1 parece interagir com o EIF4G3. Já nos ensaios de RNAi com os dois homólogos da PABP presentes em T. brucei, foi observado que as duas proteínas são essenciais para a viabilidade do parasita (da Costa Lima et al., 2010).

2.6.4 EIF4Es

Em L. major um primeiro candidato homólogo do eIF4E foi inicialmente identificado e caracterizado (LeishIF4E-1) como uma proteína citoplasmática e com afinidades equivalentes de ligação ao cap monometilado e tetrametilado (Yoffe et al., 2004). Posteriormente, um segundo trabalho foi publicado identificando os quatro homólogos de eIF4E caracterizados até o momento (Dhalia et al., 2005). Em seguida ensaios foram realizados onde se avaliou a capacidade dos quatro homólogos de reconhecer diferentes análogos sintéticos de cap e estes mostraram diferentes especificidades para cada proteína. Ao mesmo tempo, quando sua interação com a protéina eIF4E-BP1 de mamíferos foi avaliada, apenas as proteínas EIF4E1 e EIF4E4 se ligaram à GST-eIF4E-BP1 imobilizada em resina (Yoffe et al., 2006).

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Mais recentemente a viabilidade celular dos quatro homólogos de eIF4E de T.

brucei foi investigada através de ensaios de RNAi e sua interação com homólogos

de eIF4G também foi avaliada. Estes estudos resultaram na separação das quatro proteínas em dois grupos distintos. Os homólogos EIF4E1 e 2 não estariam diretamente envolvidos na tradução, mas com funções essenciais para a viabilidade celular. Já os EIF4E3 e 4, que são mais abundantes e citoplasmáticos, provavelmente estariam envolvidos na iniciação da tradução. Ensaios de interação proteína-proteína demonstraram a interação dos fatores EIF4G3/EIF4E4 e EIF4G4/EIF4E3, indicando que em tripanosomatídeos pode haver a formação de dois complexos EIF4F distintos (FREIRE et al., 2010). Estes dois complexos poderiam co-existir, realizando, por exemplo, a tradução de diferentes classes de mRNAs, como já foi visto em plantas, que possuem o complexo eIF4F e o eIF(iso)4F (Browning et al., 1992)

Estudos mais recentes foram realizados utilizando células de Leishmania

amazonensis. Foi observado através de espectrometria de massa que o EIF4E4

interage com homólogos de outros fatores de iniciação da tradução, além do EIF4G3, como homólogos de eIF5, eIF5B, subunidades dos eIF3 e eIF2, além das PABP1 e 2 e algumas proteínas ribossomais (Zinoviev et al., 2011). Em ensaios de duplo-híbrido em leveduras, a ligação do EIF4E4 com o EIF4G3 foi investigada e identificou-se que uma mutação pontual em resíduo do EIF4E4 equivalente ao W73 de mamíferos impede essa interação (Zinoviev et al., 2011). O EIF4E1 também interagiu com vários fatores de iniciação da tradução, como o EIF4AI, e homólogos das subunidades do eIF3 e eIF2 além das PABP1 e 2, com interações muito similares as do EIF4E4. Esta proteína, contudo, não foi capaz de interagir com nenhum dos homólogos do EIF4G (Zinoviev et al., 2011).

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Outro estudo com L. amazonenses, focando no EIF4E3, mostrou que este interage fortemente com o EIF4G4, porém dificilmente se liga ao cap4. Além disso, nenhum destes dois fatores co-migram com polissomas em gradientes de sacarose. Por conta disso, é provável que não atuem na iniciação da tradução global. Na microscopia confocal, o EIF4E3 foi encontrado dentro de grânulos induzidos por estresse nutricional, mas seu parceiro EIF4G4 não foi encontrado no mesmo local, o que é esperado, visto que sob esta condição, a interação entre essas duas proteínas seria diminuída. Provavelmente, no estresse, o EIF4E3 sofre alguma modificação, sendo liberado pelo EIF4G4 para entrar nos grânulos provocados pelo estresse, onde os mRNAs inativos são armazenados (Zinoviev et al., 2012).