A estrutura do SBS da PKA é bem caracterizada, tendo sido esse dividido em sub-
sítios para fins de estudos de afinidades com peptídeos (KOBE et al., 2005). Considerando
o consenso canônico de fosforilação dessa quinase ([RK][RK]X[ST]), constatamos que os subsítios essenciais para a interação são os S-3, formados pelos resíduos E127 e Y330, e o subsítio S-2, que conta com os resíduos T201, E203, Y204, E170 e E230. É possível constatar que ambos apresentam um predominante teor de resíduos com cargas negativas. Essa constatação é coerente com o consenso de fosforilação da PKA, que apresenta resíduos
com cargas positivas nas posições de interação P-2 e P-3 (figura 6A).
42 Capítulo 5. Resultados e Discussão
muito favorável (Ki =0,2 nM) (PAULUCCI-HOLTHAUZEN; O’CONNOR, 2006). Conse-
quentemente a disposição dos resíduos de P0, P-2 e P-3 nesse peptídeo apresenta uma configuração ideal para interagir com a PKA. Essa configuração pode ser vista na figura
6. Não por acaso, a maioria dos sítios de fosforilação apresenta algum resíduo básico
em sua estrutura primária nas posições P-2 e P-3. Sítios nessas condições apresentam naturalmente uma estrutura muito similar à do PKI.
Um sítio conformacional se caracteriza por apresentar uma estrutura tridimensional que mimetiza a disposição espacial do PKI, pelo menos em relação aos resíduos considerados mais importantes na interação com a quinase. Ou seja, desconsiderando a disposição na estrutura primária, avalia-se o posicionamento espacial do resíduo fosforilado e dos resíduos carregados na superfície da proteína, com base na distância dos Cα desses resíduos. Se houver semelhança na configuração desses resíduos com a do PKI, pode-se supor que essa disposição espacial faria com que o sítio de fosforilação, independente da sequência na região em que se encontra, apresentasse a estrutura do consenso de fosforilação. Consequentemente esse sítio apresentaria uma configuração favorável para interagir com uma quinase que interaja com o PKI, gerando portanto um potencial sítio conformacional.
Dessa foma, para buscar sítios conformacionais, todos os sítios sem consenso de fosforilação modelados foram submetidos a uma prospecção estrutural por resíduos âncoras (carregados positivamente). Dos 37 sítios conformacionais, 34 apresentam ao menos uma configuração que atende os critérios definidos como mínimos para definir um sítio conformacional. Desses sítios, 16 apresentam a possibilidade de formar o motivo de fosforilação com um ou dois resíduos âncoras, enquanto os demais apresentam possibilidades com um único resíduo âncora.
Dentre os três sítios que não apresentam possibilidades de resíduos âncoras na estrutura do substrato, notamos que um dos substratos, a proteína Myosin regulatory light
P0
P-2
P-3
A
B
Figura 6 – A - SBS da PKA (cinza) com os subsítio S-3 destacado em vermelho, S-2 em azul e S0 em laranja. Em verde o PKI com destaque para os resíduos que interagem nesses subsítios. B - Visão isolada do Cα dos resíduos de P0, P-2 e P-3 do PKI, com as suas respectivas distâncias.
5.2. O conceito de sítio conformacional 43
A
B
Figura 7 – A - Alinhamento da sequência do substrato com os moldes utilizados. Destacado com um retângulo laranja os dois resíduos fosforilados (T19 e S20), que já se encontra em uma região que não se alinha em nenhum molde e portanto não apresentam uma modelagem confiável. Na região entre o N-terminal e os sítios, podemos ver a existência de sete resíduos básicos próximos aos sítios de fosforilação. B - Modelo gerado com os dois resíduos fosforilados destacados em sticks laranja dispostos no limite da região modelada.
polypeptide 9 (UNIPROT: Q64122), contendo dois sítios de fosforilação juntos na sequência (T19 e S20), não foi plenamente modelado, tendo 90,6% da sequência modelada (figura
7). Os sítios ficaram no limiar da região modelada sendo que na região não modelada,
próxima ao N-terminal, existem uma série de resíduos básicos que possivelmente poderiam servir como âncoras no processo de atracamento (K4, R5, K7, K9, K12, K13, R14). Com isso, podemos considerar que apenas um dos sítios sem motivo de fosforilação explicito na estrutura primária definitivamente não apresenta uma configuração plausível de motivo estrutural de fosforilação pelos nossos critérios. Esse sítio, S182 no substrato Vitamin D3 receptor (UNIPROT: P11473), apresentou uma modelagem de qualidade baixa na região do sítio de fosforilação. Portanto, a análise da estrutura nessa região do modelo apresenta um resultado pouco confiável, tornando impossível excluir esse caso como um
44 Capítulo 5. Resultados e Discussão
A
B
Figura 8 – A - Alinhamento da sequência do substrato com os moldes utilizados. Destacado com um retângulo laranja o resíduo fosforilado (S182). B - Modelo gerado com o resíduo fosforilado destacados em sticks laranja e em azul todas as possíveis âncoras. O substrato apresenta muitos resíduos básicos em sua superfície. Mesmo que em nosso modelo nenhum esteja disposto de forma a ser utilizado como âncora para o sítio conhecido, a baixa qualidade da modelagem nessa região torna pouco confiável a estrutura nessa região e portanto as distâncias calculadas, tornando impossível descartar esse sítio como um possível sítio conformacional.
Para comparação e validação dos critérios utilizados na busca estrutural de âncoras, efetuamos a mesma busca para 486 sítios que apresentam o motivo de fosforilação linear. Para 455 casos, foi encontrado na busca estrutural os resíduos que constituem o consenso sequencial. Dos 31 casos restantes, 27 apresentaram alguma conformação de sítio estrutural plausível. Desses dados podemos concluir que os critérios de busca utilizados estão de acordo com o esperado da estrutura de um consenso de fosforilação, uma vez que a busca estrutural encontrou 93,1% dos consensos lineares existentes nos sítios modelados. Outra conclusão desse estudo é que em determinados substratos, os resíduos básicos que estão próximos ao sítio de fosforilação na sequência de aminoácidos, podem se encontrar inacessíveis na