IMPRIMANTE
MICROSCOPE
Fi2ure 13: représentation schématique d'un SAMBA 2005. Le flux lumineux est divisé en
deux parties, d'une part la voie visuelle (microscope Leitz Diaplan) et d'autre part la voie d'analyse numérisée (caméra Sony CCD). Les images captées par la caméra sont transférées à un processeur de calcul. Un autre processeur sert d'interface entre l'opérateur et l'ensemble du système.
clavier DE
commandes
Figure 14: représentation schématique d'un SAMBA 200. Le flux lumineux est divisé en deux parties, d'une part la voie visuelle (microscope Nachet) et d'autre part la voie d'analyse numérisée (capteur). Le flux lumineux, après avoir traversé la préparation histologique, est analysé par le détecteur n°I (analyse à basse résolution), ce qui correspond à la localisation de l'objet à analyser. Ce flux est ensuite analysé par le détecteur n°2 (analyse à haute résolution), ce qui correspond à la numérisation de l'image. Ces données sont ensuite traitées (processeur de traitement). Cette dernière étape correspond à la paramétrisation.
2. Principe de segmentation et de numérisation de l'image.
La figure 12 de la page 45 illustre la notion d'images "analogiques" ou "physiques", c'est-à-dire d'images telles qu'elles sont perçues par l'humain, alors que la figure de la page suivante illustre la notion d'image "numérique", c'est-à-dire l'image obtenue après son traite ment à l'aide d'un ordinateur. Comme le montrent les schémas relatifs aux systèmes SAMBA 200 (page 48) et SAMBA 2005 (page 47), l'image analogique est traitée en termes de signaux optiques à l'aide d'un photomultiplicateur dans le cas du SAMBA 200 et à l'aide d'une caméra de type "CCD noir & blanc" dans le cas du SAMBA 2005. Ce passage de l'utilisation d'un photomultiplicateur à une caméra illustre les progrès énormes accomplis ces dix dernières années dans le monde de l'électronique quant au traitement des images. Ces aspects sont traités en détail dans la thèse de Giroud (1987) et dans l'article de Brugal et coll. (1979).
Nous retiendrons donc de manière simpliste que l'image analogique telle qu'elle est perçue par l'humain est "transformée", à l'aide d'outils tels des photomultiplicateurs ou des caméras, en images numériques qui seront ensuite traitées par l'ordinateur. La première étape de cette transformation image analogique —> image numérique consiste en la segmentation de l'image. Ce processus de segmentation, encore appelé processus de binarisation de l'image, consiste à assigner à chacun des "point-images" (pixel) de l'image la valeur binaire 0 pour le "fond" et la valeur binaire 1 pour ce qui est différent du fond. Dans le cas présent, et comme l'illustre la figure ci-après, le fond correspond à la lame histologique non colorée par la méthode de Feulgen tandis que ce qui est différent du fond correspond aux noyaux cellulaires colorés spécifiquement en rouge magenta par la méthode de Feulgen. Ainsi, la figure ci-après montre l'image binarisée de quatre noyaux cellulaires. Chacun des noyaux cellulaires sera traité par l'ordinateur comme une entité propre car il est entouré d'une couronne de valeurs 0. Lorsque ce processus de segmentation de l'image est terminé, alors débute le processus de numérisation de l'image. L'ordinateur va traiter les informations numériques qui lui sont fournies par le capteur. Celui-ci est équipé de photodiodes qui associeront à chacun des pixels d'un noyau (au préalable binarisé) une valeur numérique pouvant prendre 255 valeurs différentes (s'échelonnant de 1 à 255). La figure 16 de la page 51 montre ainsi la numérisation symbolique de l'image segmentée du noyau n°3 de la figure 15 (page 50). Nous définissons comme symbolique l'image numérique de la figure 16 puisque le noyau qui y est représenté comporte seulement 333 pixels. Au grossissement xlOOO, un lymphocyte humain peut être décrit par 2000 pixels et un noyau cellulaire issu par exemple d'un cancer du sein par 20 000 pixels.
oooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 UOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOÜ 000000000000000000011111000000000000000000000000000000000000000000000000000000 0000000000000000111111111 lOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO 000000000000011111111111111100000000000000000000000000000000000000000000000000 000000000001111111111111111111000000000000000000000000111111111110000000000000 000000000011111111 h| 1111111111100000000000000000000011111111111111100000000000 000000000001111111111111111111000000000000000000001111111111111111110000000000 000000000000011111111111111100000000000000000001111111111111111111111000000000 000000000000000111111111110000000000000000000111111111111111111111111110000000 00000000000000000011110000000000000000000000111111111111113111111111111000000 000000000000000000000000000000000000000000000111111111111111111111111110000000 000000000000000000000000000000000000000000000011111111111111111111111100000000 OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOl 11111111111111111111000000000 000000000000000000000000000000000000000000000000001111111111111111100000000000 000000000000000000000000000000000000000000000000000011111111111111000000000000 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 000000000000000000000000000001111100000000000000000000000000000000000000000000 00000000000000000000000000011111111 lOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO 0000000000000000000000000111112111111OOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO 000000000000000000000000001111111111 lOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOOO 000000000000000000000000000011111111000000000000000000000000000000000000000000 000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000000 000000000000000000000000000000000000000111111111111111000000000000000000000000 000000000000000000000000000000000000111111111111111111110000000000000000000000 000000000000000000000000000000000011111111111111111111111000000000000000000000 000000000000000000000000000000001111111111111114l 1111 m 110000000000000000000 000000000000000000000000000000001111111111111111111111111110000000000000000000 000000000000000000000000000000000111111111111111111111111000000000000000000000 0000000000000000000000000000000000011111111111111111111 ooooooooooooooooooooooo oooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooooo
Figure 15; illustration du processus de binarisation de l'image de quatre noyaux cellulaires. Tous les point-images (pixels) de la préparation sont balayés par le flux lumineux. Pour chaque p)oint, la quantité de lumière absorbée est calculée. La coloration de Feulgen étant spécifique de l’ADN, seul le noyau est coloré. Chaque point-image appartenant à un noyau (valeur = 1) se différencie donc des point-images constituant le fond (valeur = 0). Ceci permet d'obtenir un masque numérique du noyau.
SRL<
NUCLEOLE. LRL
11 78 56 49 7g \
187^
55 54 101 89 87 91 89 91 98 99 89 /69 69 54 78 57 64 099 168 189156 h 54 189 1£t) 89 89 58 98 65 ^ 68 89 56 112yÎ4 8^ 7'\48 54 6 9 10 iTj 58 91 ig 68 74 9 0212 2361 89 58 78 45 79 78 1 2 5 6Wg 'U
9 787tiL
89 58V
9 4 7/
87 58 157 191 169 '84 74 (4 4 9 5J
65 881 201 202 189 187\87 58 oeA
^8 78 101Tîs\l
9§,
fîi 54 111 89 78 11 0145 78 89 91 98 78 91 85 45 89Vo
|44 41 78 65 56 54 78 112 89 114 87 52 0 0 1 214 202 2C
2)
5é\Ü
0 208 212 199^
7^0 0>
198 224ITS/Sl
69^
0,
H
8 187/89 78 48 5^0 89 112 98 84 85 54/0 98 92 58 54 7^0 0 89 112 58 75/
69V
0 5^545 250(69\o 112^2452412211^4522124l\
8yO
89 198221 1892212121891^
08 221242225 189236202^81 112\l
871991542022^9 84^0 89 89|203I
98J
8^^8996 89/0 0 87 98 65 45 87 69 89 78/0 0 0 0 0 0 79 69 541^1223TsT)
99 74 78 65 112 114 89 91 45 54 0^89202 ^112104 105 108 89 56 69 54^ o
0 0 0 0É
2B
199/îœ
103 98 97 101 111 89 liSiJo 0 0 0 0 0|
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89 65 45 89 89 78 54w/Ôo
0 0 0 0 4 78 65 59 78 54 101 114 65/0 0 0 0 0 0 0 0\45 54 89 56 98 54/OQ
0 0 0 0 0 0 00000 0 00 00 0 00000000000 0000000000000000000 0000000000000000000Figure 16: illustration du processus de numérisation de l'image binaire du noyau cellulaire n°3 présenté dans la figure précédente.
Le noyau illustré ici est représenté par 333 pixels dont les valeurs s'échelonnent de 1 à 255. Les paramètres que nous décrivons dans les pages suivantes reposent essentiellement sur l'analyse statistique de la répartition des valeurs numériques au sein du noyau. Comme détaillé ci-après, nous voyons apparaître dans le présent noyau la représentation numérique du nucléole qui correspond à un "trou" dans le noyau. Ce trou correspond à des valeurs numériques très faibles (< 20) puisqu'elles correspondent principalement à de l'ARN qui n'est pas coloré par la méthode de Feulgen. Nous voyons également apparaître des petites (SRL) et des grosses (LRL) mottes de chromatine. Comme les valeurs numériques s'échelonnent de 1 à 255, en as signant des seuils à ces valeurs, il est possible de faire "reconnaître" à l'ordinateur (par le biais de logiciels spécifiques) des zones hypochromatiques et hyperchromatiques. On peut ainsi définir que toutes les valeurs inférieures à 128 correspondent à des régions peu denses au sein du noyau et celles supérieures à 128 à des régions denses. On peut utiliser 4 seuils pour définir les régions "pâles" (<64), "peu denses" (64-128), "moyennement denses" (128-192) et "très denses" (> 192). Toutes les régions du noyau dont les valeurs numériques sont supérieures à 192 pourraient par exemple correspondre aux "régions hyperchromatiques" définies par les
3. Description des paramètres calculés par l'ordinateur. a. La taille nucléaire.
Comme le montre la figure 16 de la page 51, la taille nucléaire telle que nous la cal culons correspond en fait à la surface de la projection du noyau sur la lame histologique, c'est-à-dire au nombre n de pixels qu'occupe cette projection sur la lame histologique. Nous décrirons donc la taille des noyaux cellulaires par le paramètre "surface" (paramètre SURF) tout au long du présent travail.
b. La densitométrie du novau.
b.l. Le calcul du taux de ploïdie.
Le calcul du taux de ploïdie consiste à définir le contenu en ADN nucléaire d'une cel lule donnée et de l'exprimer en valeur relative, une cellule normale non proliférante (en phase GO-Gl du cycle cellulaire) contenant "2c quantité" d'ADN par définition. Dans le cas présent, c'est-à-dire lorsque l'on effectue une analyse cytophotométrique de préparations cellulaires soumises à la coloration de Feulgen, la détermination de la quantité d'ADN nucléaire consiste à effectuer l'intégrale mathématique sur l'ensemble des valeurs numériques (appelées aussi densités optiques, Doi) décrivant la densitométrie d'un noyau donné, comme illustré dans la figure 16 de la page 51. Ainsi, la quantité d'ADN nucléaire se mesure à l'aide du paramètre "Densité Optique Intégrée" (DOI), dont la formule est la suivante:
N
DOI = 2 DOi
i=l
Cette intégrale effectuée sur l'ensemble des valeurs numériques (Doi) qui décrivent un noyau cellulaire exprime donc le contenu en ADN d'un noyau en unités relatives de densité optique. Un noyau diploïde qui "contient" 2c quantité d'ADN contiendra par définition 2000 unités relatives de densité optique (Kiss et coll., 1992). Nous signalons que les chercheurs qui calculent la quantité d'ADN nucléaire au moyen de la cytométrie de flux expriment cette quan tité sous forme d'indice d'ADN. Cet indice d'ADN (DI) vaut 1.00 unité relative pour un noyau diploïde contenant 2c quantité d'ADN.
L'histogramme de distribution des valeurs individuelles de densité optique (Doi) au sein d'un noyau permet également de définir la loi de probabilité de la variable Doi au sein de l'image nucléaire numérisée. Comme l'ont montré Giroud (1987) et de Launoit et coll. (1990), la forme de l'histogramme est très révélatrice de la texture de l'image: s'il présente un seul pic étroit, il s'agit d'une image qualifiée de "faible dynamique" qui reflète un contraste faible au sein du noyau. En revanche, un histogramme plurimodal suggère l'existence de régions de
luminance différente au sein du noyau, et par conséquent une image nucléaire contrastée. L'histogramme de distribution des valeurs de Doi au sein d'un noyau cellulaire ne doit pas être confondu avec l'histogramme de distribution des valeurs de DOI au sein d'une population de noyaux cellulaires (voir paragraphe b.2. ci-après).
Le taux de ploïdie correspond donc à la valeur moyenne de DOI calculée sur une population cellulaire contenant au minimum 200 noyaux (voir paragraphe b.2.). Ce taux est exprimé en unités relatives de densité optique. Ainsi, une population cellulaire composée ex clusivement de cellules diploïdes non proliférantes montrera une valeur de DOI égale à 2000 unités relatives. De même, une population purement triploïde et non proliférante donnera une valeur de DOI égale à 3000 unités relatives.
Outre le paramètre DOI, quatre autres paramètres sont obtenus à partir du calcul des densités optiques au sein d'un noyau, à savoir:
1
.
2.
la densité optique moyenne (DOM) qui représente la valeur moyenne de l'ensemble des densités optiques ponctuelles du noyau:
N DOi
DOM = S ---=
i=l N
la variance des densités optiques (VOD):
N DOi^ VOD = Z ---i=l N DOI N N DOi ^ (Z ---) i=l N
ce paramètre VOD mesure l'hétérogénéité de la distribution des différents degrés de condensation de la chromatine quels que soient les degrés de condensation de la chromatine et leur organisation (Giroud, 1987; Larsimont et coll., 1989a; Petein et coll., 1990);
3. l'indice de Skewness (SK) qui correspond au moment d'ordre 3 rapporté à l'écart-type élevé au cube:
N DOi - DOM
SK = (2
ce paramètre SK, également dénommé dissymétrie de l'histogramme, est mesuré par rapport au pic majeur de densités. Au cours du cycle cellulaire, une diminution des valeurs de SK traduit une décondensation de la chromatine (Colomb et coll., 1989; Etievant et coll., 1991).
4. l'indice de Kurtosis (K) qui correspond au moment d'ordre 4 rapporté à l'écart-type
élevé au carré:
N DOi - DOM
K = ( 2
(---i=l N
ce paramètre K, également dénommé aplatissement de l'histogramme, mesure à la fois la hauteur et la largeur du pic majeur de l'histogramme de distribution des valeurs de Doi. La valeur de K augmente lorsque la hauteur du pic augmente et que sa base se res serre: ceci traduit une augmentation de l'homogénéité des degrés de condensation de la chromatine.
b.2. Le typage de l'histogramme d'ADN.
Le groupe de Bartels (Weber et coll., 1985, 1987) a prouvé qu'il suffisait de numériser l'image de 200 à 300 noyaux cellulaires pour obtenir un histogramme d'ADN par faitement résolu. Dans la plupart de nos travaux décrits dans le chapitre Résultats, nous avons analysé de 400 à 1200 noyaux cellulaires par cas.
Nous avons décrit une manière originale de typer l'histogramme d'ADN. Celle-ci fait l'objet du travail présenté en annexe n°13. De manière résumée, voici la façon dont nous avons procédé. L'histogramme d'ADN aura comme "étiquette" la valeur de ploïdie du pic GO-Gl de la population cellulaire qui le compose. Dans le cas de populations cellulaires pures quant à leur contenu en ADN nucléaire, nous avons reconnu cinq types d'histogrammes d'ADN, à savoir le type diploïde, hyperdiploide, triploïde, hypertriploïde et tétraploïde. Lorsque nous nous trouvions confrontés à des populations cellulaires mixtes en termes de taux de ploïdie, c'est-à-dire présentant plusieurs pics GO-Gl, nous avons qualifié cet histogramme de polymorphe. Nous avons ainsi reconnu au sein des diverses études menées dans le cadre de notre thèse six types d'histogrammes d'ADN. Ceux-ci sont illustrés dans la figure ci-dessous.