O gene VEGF-A e suas isoformas de splicing

A sequência gênica completa do gene VEGF-A se estende por 16.272 pares de base (pb) no cromossomo 6, banda p12 (localização 43.737.921 – 43.754.224). Camundongos knockout para Vegf-A são embrionicamente letais, tanto em homo (–/–) como em heterozigose (+/–), devido à formação imatura de vasos sanguíneos, o que indica que a concentração local de VEGF- A no embrião precisa ser muito bem regulada para que os processos de vasculogênese e angiogênese ocorram de forma a não comprometer a viabilidade do embrião (Shibuya, 2013).

O RNA heterogêneo nuclear (hnRNA) produzido a partir da transcrição de VEGF-A contém 8 éxons. Enquanto os éxons 1-5 estão presentes em todas as isoformas, é através de

splicing alternativo dos éxons 6 e 7 (e seus subéxons 6a, 6b, 7a e 7b) e seleção diferencial dos

de splicing, ou DSS – Distal Splice Site) que diversas isoformas proteicas são formadas. Quando o PSS é selecionado, o mRNA passa a conter o subéxon 8a e sua tradução leva à produção de fatores pró-angiogênicos, representados por VEGFxxx, onde “xxx” corresponde ao número de resíduos de aminoácidos nas cadeias polipeptídicas das isoformas, sendo que as seguintes isoformas já foram descritas: VEGF111, VEGF121, VEGF145, VEGF148, VEGF162, VEGF165, VEGF183, VEGF189 e VEGF206 (Anthony, Wheeler, Elcock, Pickett, & Thomas, 1994; Cheung, Singh, Ebaugh, & Brace, 1995; Houck et al., 1991; Lei, Jiang, & Pei, 1998; Lohela et al., 2009; Mineur et al., 2007; Woolard et al., 2009). Por outro lado, a seleção do DSS, localizado 66 pb a jusante do PSS, incorpora o subéxon 8b, gerando transcritos com um quadro aberto de leitura contendo o mesmo número de resíduos de nucleotídeo que as variantes VEGFxxx, mas que são traduzidos em proteínas que contêm seis resíduos de aminoácidos distintos na região carboxiterminal (Figura 1.3). Enquanto o subéxon 8a codifica os resíduos CDKPRR, o subéxon 8b codifica SLTRKD, gerando uma subfamília de proteínas antiangiogênicas mais recentemente descoberta e que são representadas por VEGFxxxb. Até o momento foram identificadas as isoformas VEGF121b, VEGF145b, VEGF165b, VEGF183b e VEGF189b, todas também capazes de se ligar aos mesmos receptores de VEGF (Bates et al., 2013; Lohela et al., 2009; Woolard et al., 2009). Diversos são os fatores que comandam a seleção PSS/DSS, como hipóxia, citocinas, hormônios sexuais, quimiocinas e fatores de crescimento (Harper & Bates, 2008).

Figura 1.3. Estrutura gênica de VEGF-A e isoformas oriundas de splicing alternativo. O gene VEGF-A se estende por aproximadamente 16,3 kb e seu hnRNA possui oito éxons (A). Diversas isoformas são geradas a partir do splicing do hnRNA, formando proteínas de diferentes tamanhos, propriedades fisicoquímicas e atividades biológicas. A seleção do subéxons 8a (TGA1) ou 8b (TGA2) resulta em duas subfamílias às quais são atribuídas atividades antagônicas: pró-angiogênese e antiangiogênese. A maioria das isoformas geradas a partir de VEGF-A são mostradas (B). Figura adaptada (Harper & Bates, 2008).

As diversas isoformas de VEGF-A possuem diferentes níveis de expressão, sendo, por exemplo, VEGF165, VEGF121 e VEGF189 mais abundantes (com destaque para VEGF165) do que VEGF145 e VEGF206. Todas as isoformas possuem uma N-glicosilação no resíduo Asn-75, mas elas também diferem quanto a suas propriedades bioquímicas, o que determina distintas propriedades biológicas. VEGF121 é um polipeptídio acídico e livremente secretado e não apresenta capacidade de ligação a heparina. Isoformas maiores possuem o equivalente proteico aos éxons 6 e 7, o que as confere a habilidade de ligação a proteoglicanos de heparan-sulfato e, por similaridade estrutural, à heparina. VEGF189 e VEGF206, isoformas altamente básicas, ligam- se com forte afinidade à heparina, ficando sequestradas na matriz extracelular (MEC). Já VEGF165 tem propriedades intermediárias, dado que é secretada mas tem uma fração significativa

retida na MEC (Napoleone Ferrara, 2004; Houck, Leung, Rowland, Winer, & Ferrara, 1992; J. E. Park, Keller, & Ferrara, 1993). Essas características fisicoquímicas são também válidas para as isoformas VEGFxxxb, dado que a substituição dos seis resíduos no C-terminal das proteínas não ocorre nos domínios que determinam tais propriedades. Além disso, todas as isoformas possuem uma N-glicosilação no resíduo Asn-75 (Pizarro et al., 2010).

A mudança dos resíduos C-terminais entre VEGFxxx e VEGFxxxb, entretanto, acarreta em alterações consideráveis, tanto que leva às ações pró- e antiangiogênicas de membros dessas duas famílias, respectivamente. Tomando VEGF165 e VEGF165b como exemplo, as principais alterações em resíduos de aminoácidos são a perda de uma Cys160 em VEGF165b e uma substituição de argininas positivamente carregadas na isoforma VEGF165 por um dipeptídeo Lys- Asp de carga líquida neutra na VEGF165b (Cébe-Suarez et al., 2008). Essas diferenças resultam em profundas implicações estruturais, de interação com receptores e de função. A ligação de VEGF165 leva à dimerização dos receptores VEGFR-2, reposicionamento do domínio tirosina- quinase por rotação da porção intracelular do receptor e indução de autofosforilação dos resíduos de tirosina 951, 1054, 1152 e 1214. Em contrapartida, ao se ligar ao mesmo dímero de receptores, VEGF165b leva a uma rotação insuficiente e fosforilação incompleta do receptor, somente nos resíduos 951, 1152 e 1214. Essa fosforilação incompleta acaba por sinalizar para degradação do receptor, não ativando vias de sinalização angiogênicas (Kawamura, Li, Harper, Bates, & Claesson-Welsh, 2008).

O desenvolvimento de anticorpos e sondas que detectam especificamente as isoformas VEGF-Axxxb revelaram que a expressão basal dessas isoformas é dominante sobre as isoformas VEGF-Axxx em diversos tecidos. A placenta é uma exceção, onde essas isoformas representam menos da metade de VEGF-A total (Bevan et al., 2008; Perrin et al., 2005). Em culturas

primárias de células, como podócitos, células do epitélio pigmentar de retina e células epiteliais colônicas, as isoformas VEGFxxxb também são predominantes. Contudo, em células de melanoma, carcinoma colorretal, câncer de bexiga e podócitos diferenciados em proliferação, as isoformas VEGFxxx compreendem a maior parte de VEGF-A expresso (Cui et al., 2004; Nowak et al., 2008; Varey et al., 2008).

Conforme mencionado anteriormente, a arquitetura de vasos no indivíduo não sofre alterações significativas em um contexto fisiológico saudável. Entretanto, uma desregulação do

status angiogênico de um tecido é um denominador comum de diversas doenças de alta

relevância.