Dans l'espoir de comprendre le mécanisme et la signification du processus de largage du
récepteur de Tf dans la poche flagellaire, nous avons étudié l'internalisation de la transferrine
dans un mutant sanguicole dont le gène unique de la VSG lipase a été détruit par recombinai
son homologue ciblée (Webb. 1994; Rolin et al, 1996).
5.2.1 Obtention du mutant nul pour la GPI-PLC chez T. brucei (H. Webb, 1994)
La recombinaison homologue ciblée s'est faite à partir des formes procycliques, étant
donné que contrairement aux parasites sanguicoles, il est particulièrement aisé de transformer
la forme "de l'insecte" par électroporation et d'obtenir des transformants stables à une fréqu
ence élevée (>10‘3/trypanosome survivant à l'électroporation) (Borst et al, 1993). Comme le
gène de la GPI-PLC n'est pas exprimé dans les cellules procycliques, le phénotype du mutant
nul ne peut devenir apparent qu'après qu'ait eu lieu la différenciation des formes métacycliques
en formes sanguicoles. La méthode la plus facile pour obtenir des formes métacycliques
infectieuses à partir de formes procycliques est la transmission cyclique à travers la glossine.
C'est ainsi que, les cellules procycliques proG du mutant nul de la lignée EATRO 1125 ont été
transformées en formes métacycliques par passage à travers la mouche tsé-tsé. Le contrôle
utilisé a lui aussi subi une transmission cyclique à partir des mêmes cellules proG EATRO
1125 de départ. Il faut noter que dans ce contrôle, le gène CAT (chloramphénicol acétyl
transférase) est inséré de manière stable dans le locus de la tubuline. Les cellules procycliques
utilisées pour la différenciation du mutant sont proches des populations naturelles de
trypanosomes afin d'accroître la probabilité de transmission cyclique réussie. Par voie de
conséquence, et contrairement aux parasites employés dans la caractérisation du récepteur de
transferrine (cellules monomorphes AnTat LIA, EATRO 1125), les cellules sanguicoles
provenant d'un passage récent dans la mouche constituent des populations de parasites
polymorphes. Les infections par des populations de trypanosomes polymorphes, proches
des infections chroniques existant à l'état sauvage, se caractérisent par une succession de
vagues de parasitémie qui résultent de la variation antigénique du parasite (voir la section
1.1.3.2B de l'introduction). Ces vagues correspondent à des populations morphologiquement
et physiologiquement différentes: les formes "slenders", caractéristiques des phases ascendan
tes de parasitémie, se différencient en formes "intermédiaires" puis "stumpies", qui
A
I5nendocytose globale
Figure 33
A Incorporation de la Tf iodée dans les cellules du mutant déficient en GPl-PLC (•) et du contrôle
(■), incubées à 30^C (moyenne ± Dév. St. de 4 expériences séparées).
B Discrimination de la fraction Tf fixée à la membrane (sensible à la pronase) (O) de celle internalisée
spécifiquement (résistante à la pronase) (□), au cours de l'incorporation de la Tf iodée chez le
contrôle. La somme des 2 fractions représente l'endocytose totale de Tf (■) (n = 2).
C Même légende qu'en B mais chez le mutant déficient en GPl-PLC (n = 2).
8 125
Les cellules ( 10 cellules/ml) sont incubées avec de la transferrine- 1 ( 1 gg; 0,5 pCi/pg) durant les
périodes indiquées, dans un milieu minimum sans sérum (milieu Baltz; Baltz et al, 1985) et en
présence d'ovalbumine 1%. Ensuite, les cellules sont lavées 2 fois par centrifugation et la radioactivité
est déterminée directement (total), ou les cellules sont incubées pendant 20 min à 4°C avec 0,01% de
pronase. Finalement, les parasites sont centrifugés et la radioactivité contenue dans le cul^t (interne) et
dans le surnageant est mesurée. Le bruit de fond est déterminé en incubant séparément 10 cellules en
présence d'un excès de 100 fois en Tf froide. Le bruit de fond a été déduit dans toutes les mesures
indiquées.
Mécanismes de largage et d'internalisation du TfR
minent au sommet des pics et dans leur phase de rechute.
5.2.2 Le phénotype de croissance atténuée, observé chez le mutant nul de T. brucei, est
corrélé à un ralentissement de l'endocytose de transferrine.
Dans la figure 33A, nous voyons que chez le mutant, dépiété préalablement en Tf
endogène, l'internalisation globale de transferrine iodée au cours du temps, à 30°C, est réduite
de plus de 30% par rapport au contrôle et ce résultat est statistiquement reproductible. Dans
le but de discriminer entre la fraction de transferrine fixée à la membrane de celle qui est
internalisée de manière spécifique durant l'endocytose du ligand, nous avons traité les cellules
prélevées en chaque point de la cinétique par de la pronase (0,01%), durant 20 minutes à 4°C.
Ensuite, nous avons séparé par centrifugation la fraction de Tf associée au surnageant de celle
associée au culot de cellules. Comme le montre la figure 33B, l'endocytose de transferrine par
les cellules du contrôle représente une endocytose typique, similaire à celle que nous avons
observée avec les cellules monomorphes du variant AnTat LIA (voir la figure 8A de l'article
de l'annexe 2). En effet, nous avons toujours observé que, durant le processus d'endocytose de
Tf, peu de temps après avoir ajouté le ligand, la quantité de Tf associée à la membrane
(pronase-sensible) est supérieure à la fraction du ligand internalisé (pronase-résistante). Après
30 minutes, les rapports entre les deux courbes s'inversent et c'est à ce moment que le plateau
commence. Ces données sont en accord avec ce qui a été observé en microscopie électronique,
lors de l'endocytose de la transferrine couplée à la peroxydase de raifort, dans des cellules
monomorphes déplétées en Tf endogène (voir la figure 7 de l'article de l'aimexe 2). En effet,
après une incubation de 2 minutes, la transferrine était détectée uniquement dans la poche
flagellaire, alors qu'après 30 minutes d'incubation, seulement les vacuoles lysosomales,
similaires à celles des eucaiyotes supérieurs, étaient marquées. Comme nous l'avons déjà
suggéré, il semble que la déplétion en Tf synchronise les cellules pour l'endocytose de
transferrine. Cependant, comme nous allons le voir, sur ce point nous n'avons pas obtenu les
mêmes résultats dans la localisation de la Tf-peroxydase avec des cellules pléomorphes.
Pendant l'endoc>lose de Tf. celles-ci apparaissent beaucoup plus hétérogènes dans leur
marquage par la transferrine. En effet, si certaines cellules ont leur poche flagellaire remplie de
ligand, on peu voir sur la même coupe ultrafme. dans d'autres cellules contiguës, des poches
partiellement marquées ou complètement vides.
En ce qui concerne le mutant (voir la figure 33C), la courbe apparaît nettement
biphasique et, même durant les premiers instants de l'endocytose, la courbe décrivant la
fraction de Tf pronase-sensiKe. se trouve toujours sous la courbe caractérisant la fraction du
ligand spécifiquement internalisée. Clairement l'état stationnaire semble être atteint beaucoup
plus rapidement dans le cas du mutant que dans le cas du contrôle mais avec une interna
lisation globale de Tf moins efîcace (voir courbe d'endocytose globale de Tf de la figure 33A).
Figure 34 Courbes de fixation spécifique de Tf-125 i chez le mutant déficient en GPI-
PLC (•) et le contrôle (■). 10^ cellules pléomorphes (carré) et du mutant nul (cercle)
sont incubées en présence de différentes concentrations de Tf-*25 pendant 6 heures à
4°C. Chaque courbe représente la moyenne de 2 expériences séparées.
L'analyse de Scatchard prédit pour les cellules contrôles un apparent de 1,1 |J.M et
un nombre de sites de fixation de 3700, alors que le mutant donne un apparent de
1,9 }iM et 2900 sites.
10^ cellules sont incubées dans des tubes, dont la paroi a été préalablement recouverte par une solution
d'ovalbumine saturante, en présence de 1% d'ovalbumine, dans un milieu minimum sans sérum (milieu
de Baltz; Baltz et al., 1985). Après 6 heures d'incubation à 4°C, les trypanosomes sont lavés trois fois
dans du tampon PSG froid en présence de 0,1% d'ovalbumine. La radioactivité associée au cellules est
déterminée à l'aide d'un compteur y. La fixation aspécifique de Tf iodée (bruit de fond) est déterminée en
incubant les cellules avec un excès de 100 fois en Tf non marquée. Les valeurs rapportées sont corrigées
par soustraction du bruit de fond. Les données de fixation de Tf sont analysées au moyen du programme
ENZFITTER (Sigma) et tes courbes sont dessinées par le même programme.
Figure 35
A Trypanosome sanguicole eontrôle (eomportant le gène reporter CAT) ineubé en présenee
de Tf-HRP (250 |ig/ml) dans du milieu de Baltz (milieu minimum sans sérum; Baltz et al, 1985)
contenant 0,2% d'ovalbumine (directement après isolement ) pendant 30 min à 30 °C. La lumière de
la poche flagellaire est entièrement occupée par le produit de la réaction cytochimique révélant la
présence de la peroxydase couplée de manière covalente à la transferrine.
B mutant nul sanguicole incubé dans les mêmes conditions. Le produit de la réaction
cytochimique se localise au niveau de la membrane de la poche flagellaire dans un certain nombre de
cellules, comme celle-ci.
C et D Trypanosomes sanguicoles déficients en GPI-PLC. Localisation
immunocytochimique d'ESAG 6 (anticorps U2, P. Borst) sur coupes fines de parasites inclus dans
le Lowicryl K4M, grâce à un anticorps secondaire de chèvre anti-IgGs de lapin couplé à des
particules d'or colloïdal de 15 nm de diamètre. Le marquage se localise dans la lumière de la poche
flagellaire en C (comme dans le cas des trypanosomes contrôles CAT), mais dans la même coupe, on
peut observer des cellules avec marquage périphérique de la poche flagellaire, comme en D, ou ne
présentant pas de marquage au niveau de cette poche (photos M. Geuskens).
Mécanismes de largage et d'internalisation du TfR
Ces données semblent refléter que dans le cas du contrôle, au cours de l'endocytose de
Tf, dans un premier temps il y a une accumulation progressive du ligand dans la lumière des
poches flagellaires de la population de parasites sanguicoles, et seulement ensuite une
internalisation massive du ligand. En outre, parallèlement à l'accumulation intraluminale de Tf,
se superpose un mécanisme continu d'internalisation du ligand. En effet, il est clair que déjà 2
minutes après l'addition du ligand, on localise sur coupe, de la Tf-peroxydase dans des
vésicules "recouvertes" (voir la figure 7a de l'article de l'annexe 2), Utilisant de la transferrine
fixée dans de la gélatine comme standard, il a été démontré que la concentration en ligand dans
les poches flagellaires de cellules sanguicoles en culture est considérablement plus élevée que
dans le milieu d'incubation (Steverding et al, 1994). Ajoutons que, dans les expériences que
nous avons faites sur des cellules sanguicoles en culture, le marquage par le produit de la
réaction à la DAB de la Tf-peroxydase est particulièrement intense dans la matrice des poches
flagellaires, alors que la concentration en Tf dans le milieu (0,25 mg/ml) est environ 10 fois
moindre que celle existant dans le sérum de l'hôte (~ 3 mg/ml) (voir la figure 7a de l'article de
l'annexe 2). Ces résultats suggèrent qu'au cours du processus d'internalisation de la transferrine
sérique, le ligand est accumulé préférentiellement dans la matrice de la poche flagellaire.
Dans le cas du mutant nul, les événements de fixation et d'internalisation du ligand semblent
être couplés de manière directe, comme si le processus d'internalisation du ligand était réalisé
directement à partir de récepteurs en majorité membranaires.
Pour déterminer si cette diminution de l'internalisation de transferrine observée chez le
mutant était bien la conséquence d'une réduction de la formation du nombre de complexes de
récepteur-ligand, nous avons titré le nombre total de récepteurs disponibles chez le mutant et
fait de même pour le contrôle, par analyse de Scatchard à 4°C (voir la figure 34). Alors que
nous estimons à plus de 3000 le nombre total de récepteurs chez le contrôle pléomorphe,
variant suivant les expériences, le mutant ne présente que 1000 à 2000 récepteurs. Ces
résultats suggèrent un ralentissement du processus de largage du récepteur chez le mutant.
Ceci est en accord avec les données obtenues par la microscopie électronique où l'on voit que,
après une incubation in vitro de trypanosomes pendant 30 min. à 30°C en présence de
transferrine couplée à la peroxydase, alors que nous détectons chez le contrôle un marquage
intraluminal important (figure 3 5A), chez le mutant, la membrane est souvent plus marquée
que la matrice (figure 35B). Cependant, si le largage du récepteur est ralenti chez le mutant,
celui-ci n'est pas aboli complètement. En effet, en microscopie électronique, à l'aide d'un
anticorps spécifique de pESAG 6 nous pouvons confirmer la présence du récepteur dans la
matrice de la poche flagellaire chez le mutant (voir la figure 35C). Remarquons qu'avec
l'anticorps anti-pESAG 6 spécifique, nous n'avons jamais pu observer un marquage de la
membrane de la poche flagellaire qui soit plus important chez le mutant que chez le contrôle,
et ceci même pour des temps très courts d'incubation a\ ec le ligand froid, après avoir dépiété,
au préalable, les cellules en Tf endogène (voir la figure 35D).
contrôle I mutant nul GPl-PLC
kDa
92
69
46
30
-cl M I CIM
Figure 36 Autoradiogramme représentant les fractions membranaires (M) et
cytoplasmiques (C) de trypanosomes sanguicoles mutants et contrôles,
sondées par technique de Western blot avec un anticorps spécifique de
pES AG 6 (u2; Ligtenberg et al., 1994), révélé par la protéine A iodée.
Chaque fraction équivaut à environ 5x10^ cellules.
Mécanismes de largage et d'internalisation du TfR
Nous devons en conclure que, outre la probable intervention de la VSG lipase dans le largage
du récepteur dans la poche flageilaire, il doit exister un processus alternatif permettant au
parasite d'assurer cette fonction essentielle à sa survie.
Comme l'indique la figure 36, dans le mutant, les formes membranaires et solubles de la
protéine pESAG 6, contenues dans les fractions membranaires et cytoplasmiques des
parasites, ont un profil de migration électrophorétique en gel SDS-PAGE qui est similaire à
celui observé chez le contrôle, excepté que, dans le cas du mutant, le composant de taille
supérieure, de 60 kDa, n'est pas détecté. Ces données suggèrent que l'ancre GPI est toujours
présente chez le mutant. A première vue, l'absence de détection chez le mutant du composant
de haute masse moléculaire pourrait s'expliquer par une altération du profil de glycosylation de
pESAG 6 chez le mutant. A cet égard, rappelons que nous avons attribué l'hétérodispersion de
la protéine pESAG 6 à une glycosylation différentielle du radical d'ancrage GPI. Ce résultat a
été confirmé dans le cas du complexe protéique pESAG 6/7 exprimé chez les formes
procycliques et dans le cas de la TfBP des formes sanguicoles de T. brucei purifiée sur colonne
d'affinité (Ligtenberg et ai, 1994; Chaudhri et ai, 1994). En effet, après avoir traité la protéine
pESAG 6 de la forme procyclique, ou la TfBP, par la N-glycosidase F, on observe que
parallèlement à une réduction de la taille de la protéine pESAG 6, l'hétérogénéité de la protéine
est maintenue. Par ailleurs, d'après des expériences d'immunodétection faites sur la TfBP
isolée à partir de variants différents, il semblerait que non seulement l'immunogénicité de
pESAG 6 mais aussi l'hétéroglycosylation de son radical GPI soit différente selon la nature
des variants étudiés (Steverding et al., 1994). Etant donné que les deux populations
sanguicoles de cellules contrôles et mutantes n'ont pas été clonées lors de leur premier passage
chez la souris, celles-ci n'ont pas été sélectionnées pour exprimer un seul type antigénique et
expriment, dès lors, plusieurs types antigéniques différents (S. Rolin, communication
personelle). Ainsi, la nature différente des variants exprimés chez le contrôle et le mutant
pourrait expliquer l'absence de détection du composant de 60 kDa de pESAG 6 chez le
mutant. Seul le clonage des cellules du contrôle et du mutant pourra permettre une analyse
plus poussée des caractéristiques du récepteur de transferrine chez le mutant.
No documento
Perfil dos cuidadores formais de idosos e motivos para a função: um estudo de caso
(páginas 42-46)