O Processo de Fim de Vida em Contexto Hospitalar

possible(s) de la mort apoptotique induite par les

parvovirus

5.1. Les protéines NS induisent l’apoptose

L’infection des cellules par un virus irradié n’induit pas l’apoptose, ce qui suggère que

l’expression du génome viral est nécessaire et permet d’exclure que la mort cellulaire est

induite par l’activation du récepteur du virus H-1 ou par une accumulation importante de

capsides au sein de la cellule. Il a été démontré, dans plusieurs études. (Caillet Fauquet et al.,

1990; Mousset et al., 1994), que la protéine multifonctionelle NS-1 est l’élément médiateur de

la cytotoxicité des parvovirus autonomes et que la transformation cellulaire rend les cellules

sensibles à l’effet cytocide de NS-1 (Mousset et al., 1994). L’utilisation d’un virus

recombinant H-1A800/GFP n’exprimant que les protéines non structurales nous a permis de

montrer que ce sont les protéines NS qui sont responsables de l’apoptose induite par le virus.

Nous avons décelé une faible accumulation de protéines VP-2 dans des cellules U937

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infectées par le virus recombinant H-1A800/GFP, ce qui résulte probablement d’une

contamination du stock de recombinant par du vims sauvage. L’infection des cellules par du

virus sauvage à une MOI comparable à celle de la contamination conduit à une production de

VP-2 identique, alors que la protéine NS-1 reste indétectable et que l’apoptose n’est pas

induite. L’ensemble de ces observations suggère donc que la protéine NS-1 est nécessaire et

suffisante pour induire l’apoptose dans les cellules U937.

L’oligomérisation du récepteur 1 au TNF-a enclenche la mort apoptotique par l’activation

d’une voie de signalisation intracellulaire directement reliée, au sein du cytoplasme, à la

Caspase-8. Cette cystéine protéase enclenche alors une cascade d’activités protéolytiques en

chaîne conduisant aux modifications morphologiques typiques de l’apoptose. Etant donné la

similitude possible de la mort apoptotique déclenchée par le virus H-1 et le TNF-a, il est

tentant de penser que la protéine NS-1 puisse activer directement un facteur cytoplasmique

associé à la voie de signalisation intracellulaire du TNFRI. La localisation des polypeptides

NS-1 est principalement nucléaire. Si c’est la fraction nucléaire qui assure l’essentiel des

fonctions réplicatives du virus (Pujol et al., 1997), une fraction de protéines NS-1 est présente

dans le cytoplasme. On peut donc imaginer que la protéine NS-1 interagit avec un facteur

cytoplasmique inducteur du programme d’apoptose. Ainsi, (i) la grande majorité des

inducteurs d’apoptose ne nécessitent pas de synthèse de novo des protéines mais agissent sur

un facteur cytoplasmique contrôlant directement ou indirectement la machine d’exécution

apoptotique; (ii) l’activation de la Caspase-3 après infection suit de très près l’apparition de la

protéine NS-1, ce qui serait en accord avec une action très directe de cette dernière sur

l’activation des Caspases. Cette hypothèse doit être confrontée avec l’observation faite par

Legendre et Rommelaere (Legendre and Rommelaere, 1994), montrant la coségrégation de la

cytotoxicité de la protéine NS-1 et de son activité inhibitrice de la transcription de promoteurs

hétérologues. Cependant, si cette inhibition se fait par un mécanisme indirect de „squelching“

des facteurs de transcription (Krady and Ward, 1995), celui-ci peut s’établir, du moins en

partie, dans le cytoplasme. Par ailleurs, NS-1 étant une protéine multifonctionelle, il est

concevable que plusieurs voies menant à la mort cellulaire soient activées par la protéine et

que l’importance de celles-ci diffère d’un système cellulaire à l’autre. Effectivement, la mort

cellulaire des cellules HIEJ4 induite par le virus MVMp semble dépendre, du moins en partie,

de la présence, dans le milieu, de l’hormone thyroïdienne (T3), dont le récepteur, le produit du

gène c-erbA, est activé par le virus au niveau transcriptionnel (Vanacker et al., 1993). Or, ce

récepteur nucléaire peut enclencher la mort cellulaire par apoptose dans certains systèmes

cellulaires (Gandrillon et al., 1994). On peut dès lors imaginer que l’apoptose observée suite à

l’infection de ces cellules soit due à l’induction du récepteur c-ErbA. Si cette hypothèse

s’avérait exacte, la dépendance de la mort cellulaire vis-à-vis de l’expression de novo de

certains gènes cibles expliquerait le temps de latence plus long observé pour l’apparition de

l’apoptose dans les cellules FREJ4, en comparaison du système U937 où l’apoptose serait

directement déclenchée au sein du cytoplasme indépendamment du noyau. On ne peut

cependant pas exclure une participation possible de c-ErbA à l’apoptose induite par le virus

H-1 dans les cellules U937, sachant que l’apoptose activée via ce récepteur a été démontrée

dans des cellules d’origine hématopoïétique (Gandrillon et al., 1994).

La protéine NS-2 agit de façon synergique avec NS-1 dans l’induction de la mort cellulaire

des cellules transformées (Brandenburger et al., 1990; Legrand et al., 1993), mais son rôle est

cependant restreint dans des cellules non originaires de l’hôte naturel. La protéine NS-2

s’associe aux membres de la famille des protéines 14.3.3 (Brockhaus et al., 1996), mais la

fonction de cette association pour le cycle viral est actuellement inconnue. Une implication

possible de la formation de ces complexes dans l’apoptose peut être envisagée, étant donné le

rôle que jouent les protéines 14.3.3 dans la régulation de ce processus. En effet, il a été montré

récemment que ces protéines peuvent s’associer à la forme phosphorylée de la protéine Bad,

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l’empêchant ainsi d’inhiber les fonctions antiapoptotiques de la protéine Bcl-XL (Gajewski

and Thompson, 1996). On peut imaginer que l’association de la protéine NS-2 aux protéines

14.3.3 puisse mener à la libération de la protéine Bad et à la levée de l’inhibition sur

l’apoptose qu’exerce la protéine Bcl-XL; NS-2 contribuerait ainsi de manière positive au

processus apoptotique par l’activation d’une voie peut-être différente de NS-1.

5.2. Parallélisme possible avec l’action du TNF-a

Nous proposons que la voie de transduction du signal enclenchée par NS-1 est partiellement

commune avec celle du TNF-a dont l’activité antitumorale a été reconnue depuis longtemps

(Tewari and Dixit, 1996). Cette hypothèse s’appuie sur plusieurs résultats. Premièrement, les

clones RU, résistant à l’activité cytophatique du virus H-1, ne sont que partiellement sensibles

à la cytokine TNF-a. Deuxièmement, le TNF-a est connu pour induire une répression de

l’expression de c-myc dans certains systèmes cellulaires (Hori et al., 1994; Greenblatt and

Elias, 1992). De même, le virus H-1 provoque une inhibition complète de l’accumulation des

ARN messagers, ainsi que de la protéine c-Myc, dans les cellules U937 parentales.

Troisièmement, l’infection par le virus H-1 active au moins deux phospholipases, une

sphingomyélinase (clivant la sphyngomyéline en céramide) et une phospholipase de type C

et/ou D spécifique de la phosphatidylcholine, lipases également activées par le récepteur I du

TNF-a (Levade et al., 1996; Schutze et al., 1992). Le céramide est connu pour induire la

différenciation et l’inhibition de l’expression de c-myc dans certaines lignées cellulaires (Kim

et al., 1991; Wolff et al., 1994). U a également été montré que la PKCÇ peut être activée par le

céramide. La PKCÇ conduirait à la translocation nucléaire du facteur NFkB (Lozano et al.,

1994). Le clivage de la PC par la PC-PLC engendre du DAG connu pour activer certaines

isoformes de PKC (Dekker and Parker, 1994). La PC-PLD catalyse la formation, à partir de la

PC, d’acide phosphatidique (PA) qui sera transformé ultérieurement en DAG (English et al.,

1996). Il a été proposé que le PA active la PKCÇ (Limatola et al., 1994). La NADPH oxydase,

une enzyme qui catalyse la formation d’anions superoxides, semble constituer une autre cible

de la PA (English et al., 1996). Un autre argument indirect plaide en faveur de notre

hypothèse; aucune modification apparente des protéines Bcl-2, Bax et Bcl-XL n’a été

observée après infection par le virus H-1 (Fig. 28). Ceci peut être rapproché du fait que la voie

de mort cellulaire apoptotique induite par le TNF-a n’est que partiellement sensible au

contrôle exercé au niveau de la mitochondrie par les différents membres de la famille Bcl-2

(Liu et al., 1996). Ainsi, la voie du TNF-a et du ligand Fas semble activer une (ou plusieurs)

Caspase(s) dite(s) „en amont“ (la Caspase-8) (Muzio et al., 1996) qui à son tour activerai(en)t

d’autres Caspases pouvant dès lors cliver leur(s) substrat(s) (Fig. 9). Il convient toutefois de

remarquer que seuls les trois membres actuellement les mieux caractérisés de cette famille ont

été testés; nous ne pouvons donc pas exclure que d’autres protéines de type Bcl-2

interviennent lors de l’infection par H-1. Par ailleurs, il est également possible que les trois

protéines testées subissent des modifications posttraductionelles (du type phosphorylation par

exemple) qui modulent leur activité et ne sont pas révélées dans nos expériences de „Western

Blotting“.

Les différents résultats obtenus nous ont incité à tester si le virus H-1 induit les cellules U937

à produire du TNF-a comme cela a été montré pour d’autres virus tels que Influenza et VIH

(Macchia et al., 1993; Sprenger et al., 1994). Aucune évidence d’une production majeure de

TNF-a lors de l’infection par le virus H-1 n’a été obtenue par des tests Elisa ou au moyen

d’un anticorps neutralisant la cytokine. Une autre possibilité serait que le récepteur du virus

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H-1 soit apparenté au récepteur du TNF-a, et que l’association du virus à ce dernier active le

récepteur et enclenche un phénomène d’apoptose. Ce scénario est observé pour le rétro virus

ALV (Cytopathic Avian Leukosis-Sarcoma Virus) dont l’association au récepteur cellulaire

CARI induit la mort cellulaire programmée. En effet, CARI est structurellement apparenté au

TNFRl et contient un „death domain“ dans sa partie C-terminale (Brojatsch et al., 1996).

L’incapacité d’un virus H-1 inactivé par irradiation à enclencher l’apoptose n’étaye pas cette

hypothèse. Etant donné que le polypeptide viral NS-1 est suffisant pour induire le programme

d’apoptose dans les cellules U937, on peut imaginer que cette protéine interagisse avec un ou

plusieurs composants de la voie intracellulaire activée par le récepteur au TNF-a ou par un

proche membre de la famille (Fig. 36). Il a été montré récemment que la protéine LMPl du

virus EBV interagit avec la protéine Traf3 impliquée dans l’activation du facteur NFkB. Ceci

montre que d’autres virus interfèrent avec des voies spécifiques de transduction du signal du

TNF, même si dans ce cas précis, la conséquence de cette interaction est une inhibition du

processus apoptotique par activation de NFkB (Eliopoulos et al., 1996). Il serait donc

intéressant de déterminer si la protéine NS-1 peut interagir avec l’un ou l’autre des cofacteurs

intracellulaires des récepteurs de la superfamille du TNFRL

L’oncoprotéine c-Myc sensibilise les cellules à l’apoptose induite par le TNF-a (Janicke et al.,

1996), ce qui pourrait être imputé à l’activation de la transcription de gènes proapoptotiques

cibles de c-myc. Ainsi, des cellules normalement résistantes au TNF-a deviennent sensibles à

la cytokine si l’oncoprotéine y est surexprimée (Janicke et al., 1994). D’autres travaux par

contre, plaident en faveur d’une activation directe de la Caspase-8 par le récepteur TNFRl

(Hsu et al., 1996) en absence de toute synthèse protéique, ce qui est en accord avec le fait que

la cycloheximide accélère l’apoptose plutôt qu’elle ne l’inhibe. D’autre part, la protéine Bcl-2

n’assure qu’une protection partielle des cellules contre l’apoptose induite par le TNF-a. Bien

que ces différents résultats paraissent contradictoires, il est concevable que deux voies

d’apoptose qui ne sont pas mutuellement exclusives, coexistent au sein des cellules, l’une

requérant l’induction de gènes cibles, l’autre pas. H a été montré que le TNF-a peut avoir un

effet négatif sur la prolifération cellulaire (Baker and Reddy, 1996; Decoster et al., 1995; Hori

et al., 1994). Un tel signal pourrait, comme c’est le cas pour la privation de sérum,

promouvoir l’apoptose activée par c-Myc. Il y aurait ainsi coopération entre l’apoptose induite

par le récepteur via l’activation directe des Caspases et l’apoptose résultant d’une inhibition

de la croissance par le TNF-a et ayant pour intermédiaire l’oncoprotéine c-Myc (Fig. 37).

L’observation que la mort apoptotique induite par le TNF-a dépend partiellement de la

présence de mitochondries et/ou peut être en partie inhibée par la protéine Bcl-2, peut

s’expliquer si l’on tient compte de la part que c-Myc joue dans le processus apoptotique induit

par le TNF-a. En effet, l’apoptose dépendante de c-Myc fait intervenir des facteurs

mitochondriaux et est inhibée par Bcl-2 (Bissonnette et al., 1992; Fanidi et al., 1992). L’effet

négatif du TNF-a sur la croissance inclut également une inhibition de l’expression de c-myc,

cependant celle-ci n’est pas immédiate, ce qui laisserait le temps à l’oncoprotéine d’activer

des gènes cellulaires proapoptotiques. La résistance au TNF-a des clones RU et la faible

expression de l’oncoprotéine c-Myc dans trois d’entre eux pourrait être mis en corrélation. En

effet, la faible accumulation de c-Myc et l’expression stable de Max; ont pour conséquence

probable de favoriser la formation des homodimères Max par rapport aux hétérodimères c-

Myc/Max, et de réprimer les gènes activés par c-Myc et impliqués dans l’induction de

l’apoptose étant donné l’effet inhibiteur exercé par Max/Max. H convient toutefois de

remarquer que l’un des clones, RU3, exprime c-Myc à un taux équivalent à celui du parent et

montre une résistance au TNF-a relativement importante. D’autre part, les cellules RU,

comme les cellules parentales, deviennent sensibles à l’induction d’apoptose si de la

Famille des

récepteurs

TNF-R1

PC-PLC PC-PLD

SPM

Différenciation ^

Inhibition de |

c-myc

Figure 36: NS-1 et la voie

intracellulaire du TNF-a.

Cibles possibles de NS-1 parmi

les partenaires du TNFRI.

DAG (diacylglycérol),

PC (phosphatidylcholine),

PA (phosphatidic acid),

PLC (phospholipase C),

SPM (sphyngomyeline),

SPMase (sphyngomyelinase), . ^ ^

ROS (reactive oxygen species), ActivatiOn de l>lrld3

TRAF (TNF receptor associated factor),

FADD (Fas associated death domain),

TRADD (TNF receptor associated death domain).

I

t

T

Production de

ROS

€-8

Caspaic

Apoptose

"Double signal" _/ ^TNF-a

c-Myc ^Progression

du cycle cellulaire

"conflictuel"

Progression du cycle cellulaire

c-Myc

Conflit

I

Apoptose

Signaux d'arrêt de

croissance:

Traitement au

TNF-a

Figure 37: Modèles de la contribution de l'oncoprotéine c-Myc à l'induction

de T apoptose par le TNF-a.

71

cycloheximide est ajouté au TNF-a. D est donc probable que, même si la faible accumulation

de l’oncoprotéine c-Myc dans les clones RUl, RU2 et RU4 intervient dans la résistance de ces

cellules à la toxicité du TNF-a, un autre mécanisme doit être pris en compte pour expliquer

rétablissement de cette résistance.

5.3. Activation possible du facteur NFkB dans les

clones RU

n a été établi récemment que l’activation du facteur NFkB par le TNF-a n’intervient pas dans

l’induction de Tapoptose mais a, au contraire, un effet inhibiteur sur la mort cellulaire en

stimulant la transcription de gènes de résistance (Fig. 13). Ainsi, des fibroblastes dérivés de

souris „knockout“ RelA-/- sont sensible à l’activité cytotoxique du TNF-a alors que les

fibroblastes sauvages ou dérivés de souris „knockout“ pour la protéine p50 de la famille

NFkB sont résistants (Beg et al., 1995). L’expression ectopique de la protéine RelA dans ces

cellules mutantes prévient la mort cellulaire (Beg and Baltimore, 1996; Van Antwerp et al.,

1996; Wang et al., 1996). A ce jour, les produits de trois gènes sont connus pour inhiber

l’apoptose induite par le TNF-a (hsp70; A20; SOD [Baichwal and Baeuerle, 1997; Janicke et

al., 1994]), mais l’implication du facteur NFkB n’a été démontrée que pour la régulation

promoteur du gène de la protéine A20. Le facteur NFkB est activé par le TNF-a dans les

cellules U937 (Andrieu et al., 1995), mais cette activation n’est pas suffisante pour que les

cellules résistent à la mort cellulaire induite par la cytokine. Toutefois, si la synthèse de

protéines est bloquée simultanément par de la cycloheximide, l’entrée des cellules en apoptose

est accélérée et massive (environ deux heures de traitement par le TNF-a et la cycloheximide

suffisent pour obtenir 100% de clivage de la PARP, Fig. 30). Par contre, les clones dérivés

RU montrent une résistance non négligeable à la cytotoxicité du TNF-a. Cette résistance est

supprimée si les cellules sont traitées simultanément par de la cycloheximide (Fig. 30). Ces

observations laissent à penser que l’activation du facteur NFkB pourrait être supérieure dans

les cellules RU, en comparaison des cellules parentales. Nous avons testé cette hypothèse en

transfectant les différents clones par un plasmide contenant trois sites de réponse à NFkB

associés à un promoteur minimal contrôlant le gène rapporteur luciférase (Fig. 34). Nous

avons observé que l’activation du promoteur par le TNF-a est systématiquement plus élevée

dans les clones RU (dans une moindre mesure dans le cas du clone RU2) que dans les cellules

parentales, ce qui suggère que l’activation du facteur NFkB est accrue dans les variants

résistants RU. Une telle propriété pourrait expliquer, du moins en partie, la résistance des

clones RU au TNF-a. Cependant, les résultats de ces transfection doivent être analysés avec

précaution car les activités luciférase absolues varient fort entre les clones ce qui pourrait

provenir d’une différence interclonale dans l’efficacité de transfection. Toutefois, les rapports

des activités luciférase entre échantillons traités et non traités sont systématiquement plus

élevés dans les clones RU par rapport aux cellules parentales. De plus, le fait que les clones

RU traités simultanément par le TNF-a et la cycloheximide deviennent entièrement sensibles

à la toxicité du TNF-a, est en accord avec la capacité accrue de ces clones à activer des gènes

de résistance à l’apoptose. Dans certaines cellules, dont la lignée U937, le facteur NFkB est

présent et actif de manière constitutive (May and Ghosh, 1997, Frankenberger et al., 1994).

Nous avons, dans un premier temps testé la présence du facteur NFkB dans les noyaux des

cellules U937 parentales et des dérivées RU en absence de toute induction, par la technique de

retard électrophorétique sur gel de polyacrylamide. La Figure 35 montre la présence dans les

clones RU (en particulier dans le clone RUl) d’un complexe supplémentaire, absent des

72

extraits nucléaires des cellules parentales. La nature et la signification de ce complexe ne sont

pas déterminés, mais l’implication de NFkB dans la survie cellulaire et la défense

antimicrobienne laisse entrevoir un rôle possible du complexe NFkB spécifique des clones

RU dans la résistance de ces cellules à l’induction d’apoptose par les parvovirus. Des

expériences de „supershift“ utilisant des anticorps dirigés contre les différents membres de la

famille Rel/NFKB permettraient de déterminer quelles sont les protéines prenant part à la

formation du complexe en question. Le TNF-a conduit à la translocation nucléaire d’au moins

5 dimères dans la lignée humaine Hela. Il s’agit des complexes P50/P65, P50/c-Rel, P65/c-

Rel, P52/c-rel et P52/P65 (Beg and Baldwin, 1994), toutefois la fonction de chaque complexe

n’est pas déterminée. NFkB peut être activé par les dérivés activés de l’oxygène (Los et al.,

1995) et semble être impliqué dans la réponse antivirale vis-à-vis du virus VIH (May and

Ghosh, 1997). De plus, une molécule apparentée au membre pl00/pl05 de la famille NFkB

(nommée „relish“) a été identifiée chez la Drosophile comme étant impliquée dans la réponse

antibactérienne (Dushay et al., 1996).

6. Modèle hypothétique d’action du virus H-1 dans

No documento A pessoa em fim de vida no serviço de urgência: abordagem terapêutica dos profissionais de saúde (páginas 46-52)