O Sistema Mating Type e o Ciclo de Vida de M perniciosa

Baseado no genoma draft do biótipo C de M. perniciosa publicado em 2008 (Mondego et al. 2008), Kües & Navarro-González (2010) realizaram uma análise da estrutura genética dos loci mating type presentes e identificaram um exemplo de um fungo homotálico primário que contém em seu genoma uma estrutura genética tetrapolar. Previamente, Cotomacci (2004) já havia identificado genes do sistema

mating type usando dados do projeto genoma de M. perniciosa, indicando a

presença de um sistema genético tetrapolar neste fungo. É importante ressaltar que este fungo apresenta os fenômenos pós cruzamento que estão sob controle dos genes do mating type em fungos heterotálicos, como pareamento nuclear, divisão

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sincronizada dos núcleos, produção de células grampo e formação de basidioma (Griffith & Hedger 1994).

A espécie apresenta dois outros biótipos, conhecidos como biótipo S e biótipo L e, curiosamente, o biótipo L foi identificado como sendo um fungo heterotálico com sistema tetrapolar. O S, por sua vez, também comporta-se como homotálico (Griffith & Hedger 1994). Outra doença do cacau, a monilíase, é causada por um espécie do mesmo gênero de M. perniciosa, chamada Moniliophthora roreri. Curiosamente, este fungo não produz basidioma, suas hifas encontram-se uninucleadas sem grampos de conexão e apresenta estruturas conhecidas como conídios (Griffith et

al. 2003). Embora tais estruturas tenham sido denominadas conídios (produto da

mitose), há evidências que a produção de esporos é resultado do processo de meiose (Evans et al. 2002). Além disso, estudos verificaram a formação de híbridos entre este fungo e o biótipo L de M. perniciosa (Griffith et al. 2003). A classificação deste fungo quanto a sua compatibilidade sexual, no entanto, não está bem definida, não há evidências que indiquem a natureza homotálica ou heterotálica desta espécie.

M. perniciosa é um fitopatógeno hemibiotrófico (Evans 1980), para o qual

existem evidências de que a transição entre as fases biotrófica e necrotrófica da interação ocorre sincronicamente aos sintomas da doença Vassoura de Bruxa (Figura 5). O ciclo da doença inicia-se com a produção de basidiósporos a partir de basidiomas em tecidos de plantas previamente infectadas, os quais irão germinar, em condições de alta umidade, e penetrar em tecidos meristemáticos de cacau (Evans 1980). A fase biotrófica da interação se caracteriza pela presença de um micélio colonizando os espaços intercelulares. Nesta fase, se considera que os tecidos são infectados unicamente por um micélio monocariótico (Evans 1980). Os principais sintomas observados no cacau neste estágio da doença caracterizam a chamada “vassoura-verde”, na qual os tecidos apresentam hiperplasia e hipertrofia e perda de dominância apical (Meinhardt et al. 2008). Após um a dois meses, ocorre a morte e a necrose dos tecidos, estado conhecido como “vassoura-seca”, na qual o fungo estará em sua fase necrotrófica da interação, formada por um micélio dicariótico com grampos de conexão e com crescimento inter e intracelular (Evans

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1980). Períodos alternados de seca e de umidade alta podem induzir a formação de basidiomas na vassoura-seca, com subsequente esporulação, o que completa o ciclo da doença.

A correlação entre os dois estágios da doença, biotrófico e necrotrófico, com o evento de dicariotização do basidiomiceto foi sugerida no estudo de Evans (1980) (Figura 5). No entanto, os fatores que orquestram tal evento não são totalmente conhecidos. Evidências indicam a atuação da oxidase alternativa mitocondrial (AOX) no ciclo de vida de M. perniciosa (Thomazella et al. 2012) na manutenção do micélio monocariótico. O estudo in vitro (Thomazella et al. 2012) revelou que a inibição da cadeia principal e consequente indução da respiração via AOX permitiu o crescimento do micélio monocariótico por um longo período. Curiosamente, a manutenção do crescimento do fitopatógeno biotrófico ex planta é muito difícil, devido a sua instabilidade, assim a dicariotização do micélio normalmente ocorre em 14 dias.

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Figura 5. Ciclo de vida e desenvolvimento da doença Vassoura de Bruxa. Os esporos são

produzidos em basidiomas encontrados em plantas previamente infectadas.O ciclo da doença inicia- se com a germinação destes esporos, que infectam os tecidos meristemáticos apicais. Na fase inicial, em que há uma interação biotrófica, o fungo no estado monocariótico ocorre nos espaços intercelulares e a doença apresenta sintomas no cacau de intumescimento dos ramos caracterizando a vassoura-verde. Com o progresso da doença, inicia-se a fase necrotrófica, marcada pela necrose, seguida por morte, do tecido da planta. Nesta fase tem-se um micélio dicariótico infectando os espaços inter- e intracelulares. Este desenvolvimento da doença é concomitante ao ciclo de vida do fungo, que se completa com a produção dos basidiomas, na etapa final da doença, conhecida como vassoura-seca. Nota-se que o fungo realiza a dicariotização durante a infecção, de forma que tal processo ocorre sem a necessidade de uma hifa geneticamente distinta, sendo este, portanto, classificado como homotálico primário.

Na literatura, encontram-se descritos casos em que há uma relação entre a patogenicidade do fungo e o sistema mating type. O exemplo mais conhecido consiste no fungo Ustilago maydis, agente causal da doença “carvão do milho” (Zea

mays), em que a dicariotização e a patogenicidade são dependentes e estão

intimamente ligadas. U. maydis é capaz de induzir a doença apenas em seu estado dicariótico (Feldbrügge et al. 2004), sendo que as células haploides são saprofíticas e não patogênicas (Kronstad & Leong 1990). Nesta espécie, portanto, o cruzamento

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entre duas células haploides compatíveis é um pré-requisito para a infecção, um evento que é controlado pelos loci a e b do sistema mating type (Vollmeister et al. 2011).

Embora o sistema genético mating type seja extensivamente estudado, o fungo M. perniciosa é o primeiro exemplo de um fungo homotálico que contém a estrutura genética tetrapolar. Desta forma, estudos que visam entender o funcionamento e atuação dos genes envolvidos no mating tem o potencial de trazer novas descobertas sobre formas alternativas dessa via de regulação. Além disso, trata-se de um possível exemplo de transição evolutiva recente ao estado homotálico, que pode ter ocorrido em um contexto evolutivo relacionado à fitopatogenicidade. Finalmente, o entendimento das bases moleculares do homotalismo pode revelar uma maneira de se verificar o modelo atual da doença, em que a transição de fases da Vassoura de Bruxa coincide com a transição morfogenética do fungo. A elucidação deste modelo poderá também identificar se mecanismos de fitopatogenicidade encontram-se sob controle do sistema mating

type e uma possível relação entre a fitopatogenicidade e o mating pode fornecer

uma base importante para o desenho racional de compostos antifúngicos, visando o controle efetivo da doença através do bloqueio da dicariotização.

19 OBJETIVOS

O presente trabalho teve como objetivo a compreensão das bases moleculares do homotalismo primário do fungo Moniliophthora perniciosa biótipo C e a análise do perfil transcricional dos genes que atuam na dicariotização. Com este intuito, o trabalho inclui a identificação e caracterização dos loci mating type e genes que participam do processo de dicariotização em uma versão mais completa do genoma, além da análise do perfil de expressão destes genes durante o ciclo de vida do fungo.

Adicionalmente, foi realizada a comparação entre os loci mating type deste fungo com a espécie Moniliophthora roreri.

Etapas do trabalho:

1. Entender as bases moleculares do homotalismo em M. perniciosa.

1.1 Caracterização dos loci mating type no genoma. (Análises in silico) 1.2 Identificação dos genes participantes da dicariotização. (Análises in silico) 1.3 Avaliação do estado de ativação e a sensibilidade dos receptores de feromônio aos feromônios do próprio indivíduo. (Modelo de expressão heteróloga em S. cerevisiae)

1.4 Avaliação da influência de um transposon identificado sobre o locus A. (Análises in silico, Verificação dos transcritos e Southern blotting)

2. Avaliação da regulação transcricional durante o mating (dicariotização) in vitro. (Análise de bibliotecas de RNA-seq e Real Time qPCR)

20 MATERIAL E MÉTODOS

1. Material biológico e Condições de crescimento