O uso do LPS (lipopolissacarídeo) em modelo animal

As evidências clínicas e experimentais sugerem um papel importante para as infecções respiratórias no desenvolvimento de exacerbações na asma (Starkhammar et al., 2012). Infecções respiratórias de vias aéreas superiores foram associadas com 80% de exacerbações de asma em crianças e 50% de

todos os episódios de asma em adultos (Micillo et al., 2000). Considerada como grande contribuinte para os custos relacionados à asma, as exacerbações são causadas principalmente por infecções bacterianas e virais (Newcomb et al., 2009; Busse et al., 2010).

Agentes virais, particularmente rinovírus humano C, vírus respiratório sincitial e influenza A parecem ser as ameaças mais prevalentes e recorrentes. Porém, agentes bacterianos, em menor grau, podem desempenhar um papel importante podendo desenvolver um quadro de co-infecção e piorar o prognóstico desses pacientes (Sandrock e Norris, 2014).

A fim de estudar os efeitos das respostas inflamatórias no hospedeiro que sofre infecção bacteriana, quadro comum dos pacientes asmáticos não eosinofílico, os modelos experimentais contribuem com importantes informações a esse respeito e permitem a elaboração de novas estratégias terapêuticas (Hussain e Kline, 2001).

O uso de LPS (lipopolissacarídeo) fornece essas informações. Conhecido como endotoxina, é uma molécula derivada da membrana celular externa de bactérias gram-negativas (Tuin et al., 2006). Composto por bicamada lipídica (lipídio A) e uma cadeia de dissacarídeo, o LPS é um importante ativador da resposta inata imune via receptor Tol Like 4 (TRL4) e tem pouca toxicidade quando utilizado diretamente em células (in vitro). Atualmente, LPS é considerado o principal fator responsável pelas manifestações tóxicas de infecções por bactérias gram-negativas (Rietschel et al., 1994).

O reconhecimento do LPS é mediado ainda por outras moléculas como LBP, a proteína ligante de LPS (do inglês, Lipopolysaccharide Binding

Protein), a proteína CD14 que pode estar sobre a forma solúvel na circulação ou

ancorada à membrana celular (sCD14 e mCD14, respectivamente) e ainda a proteína mielóide diferenciadora 2 (MD-2) que também pode ser encontrada nas duas formas. As proteínas LBP, MD-2 e CD14 na versão solúvel atuam como proteínas auxiliares, responsáveis por transferir LPS para o receptor TLR4 ou para o complexo formado entre o receptor TLR4 e a proteína MD-2 (Shimazu et

al., 1999; Akira e Takeda, 2004). Esse complexo é considerado como a principal

forma de reconhecimento do LPS (Figura 8).

Figura 8 - Via de ativação dos receptores por LPS e a ativação da translocação nuclear do NF- kB e de outros fatores de transcrição. (Adpatado Villar J. Crit Care 2004)

Nos últimos anos para a reprodução de modelos de lesão pulmonar aguda (LPA) tem sido utilizada a administração de LPS (Petroni et al., 2015; Venancio et al., 2016). Sendo considerado dose-dependente, os modelos que utilizam LPS a fim de estudar as respostas inflamatória do hospedeiro que sofre

infecção bacteriana, tem utilizado doses de 5 mg/kg ate 100 mg/kg (Tang et al., 2014; Abdelmageed et al., 2015; Fodor et al., 2016; Deng et al., 2017).

Fodor et al. (2016) utilizaram doses crescentes de LPS (3, 5, 10 mg / kg) em modelos experimentais em ratos para quantificar a gravidade do efeito dose-dependente. Os autores concluíram que os achados confirmaram a sepse e o dano da membrana alveolar-capilar de uma maneira dependente da dose e do tempo de exposição.

Em modelos experimentais de inflamação alérgica associado ao LPS é pouco relatada. Lowe et al. (2015) utilizaram um modelo experimental de inflamação alérgica associado a inalações repetidas de LPS. O grupo mostrou que a exposição ao LPS exacerba as respostas inflamatórias e leva a hiperrresponsividades das vias aéreas, além de diminuir a sensibilidade ao corticosteróide.

Starkhammar et al.(2012) utilizaram um modelo experimental com baixa dose de LPS (0,1 mg / ml) e demonstraram aumento da hiperreatividade das vias aéreas e ativação de inflamação neutrofílica.

Corroborando com esses achados, Bae et al. (2017) utilizando um modelo knockout para IL-17A, verificaram diminuição de IL-6, neutrófilos e ausência de IL-17A. No entanto, quando compararam com modelo experimental de inflamação alérgia induzida por ovoalbumina associado ao LPS, observaram um aumento de IL-4, IL-5, IL-6 e IL-17 em camundongos sensibilizados com ovoalbumina e LPS.

Baseado nesses dados, acreditamos que o modelo experimental de inflamação alérgica crônica, associado a baixa dose de LPS é útil para provocar uma resposta exacerbada, simulando o que ocorre nos pacientes asmáticos graves, a fim de fornecer respostas sobre os mecanismos reguladores e moduladores do perfil Th17 e seu envolvimento com a asma.

1.1.3 Inibidor da IL-17

Estudos prévios envolvendo anticorpos monoclonais anti-IL-17 demonstraram a influência potencialmente benéfica destas drogas em alguns aspectos da fisiopatogenia de doenças pulmonares inflamatórias agudas e crônicas (Schnyder-Candrian et al., 2006; Barlow et al., 2011). Nas doenças autoimunes, incluindo artrite reumatóide e psoríase os efeitos positivos dessa terapia também têm sido documentados (Sarkar et al., 2009; Hueber et al., 2010; Puig, 2017).

Corroborando com esses achados, em modelo animal Gu et al. (2017), utilizaram o anti-IL-17 em rinite alérgica, após repetidas inalações com OVA. O bloqueio dessa via foi capaz de diminuir a infiltração de eosinófilos e neutrófilos, redução das respostas de Th2 e Th17.

Recentemente, Weathington et al.(2017) mostrou que IL-17E está ligada a via de sinalização NF-kB e o bloqueio dessa citocina com anti-IL-17, foi capaz de suprimir a ativação dessa via de sinalização, além de diminuir as respostas de citocinas do perfil Th2.

Em estudos clínicos em humanos, o uso brodalumab (anti-IL-17), mostrou efeitos positivos nas doenças auto-imunes, porém na asma existe

apenas um estudo em humanos que utilizaram o anti-IL-17 e avaliaram se essa terapia é segura para pacientes asmáticos moderados e graves. Houve a necessidade de interromper o estudo devido aos efeitos adversos e os resultados prévios mostraram poucos benefícios com essa terapia. Os autores concluíram que a utilização dessa terapia para grupo de asmáticos de alta reversibilidade ainda é incerto, sendo necessário mais estudos a fim de entender os mecanismo envolvidos nessa população (www.clinicaltrials.gov NCT01199289) (Papp et al., 2012; Buss et al., 2013; Nirula et al., 2016).

Nota-se que a influência da IL-17 sobre aspectos das vias sinalizadoras, estresse oxidativo, remodelamento e modulação de citocinas inflamatórias no parênquima pulmonar ainda não foram estudados em modelos experimentais de inflamação pulmonar alérgica crônica exacerbado. Portanto, os conhecimentos dos mecanismos envolvidos nesses processos podem fornecer oportunidades de controle da doença.

2 Justificativas do estudo

Diante destas informações anteriormente apresentadas sobre o papel do perfil Th17 em pacientes asmáticos, mostramos a relevância de buscar e avaliar novas opções terapêuticas que possam contribuir para o maior controle dos asmáticos graves, incluindo as situações associadas a exacerbações por infecção. Mostramos também a importância do parênquima pulmonar na asma, considerado como um desafio terapêutico aos pesquisadores a fim de desenvolver novas tecnologias e drogas que permitam uma melhor oferta de agentes antiinflamatórios à porção distal do pulmão e a participação nos processos fisiopatológicos da asma.

Contudo, nota-se que há alguns trabalhos sugerindo a contribuição da IL-17 na hiperresponsividade e modulação do processo inflamatório em modelos experimentais. No entanto, esses e outros aspectos como por exemplo: vias de sinalização NF-kb e Rho quinase, estresse oxidativo e modulação do processo de remodelamento ainda não foram elucidados em modelos experimentais de inflamação pulmonar alérgica crônica associado ao LPS. Nossa intenção foi utilizar essa terapêutica anti-IL-17 em modelo de inflamação alérgica crônica incluindo também um grupo com exacerbação por LPS.

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O objetivo do presente estudo foi avaliar os efeitos do tratamento com anticorpo neutralizador anti-IL-17 nos septos alveolares em camundongos com inflamação pulmonar alérgica crônica exacerbada por LPS, avaliando:

A. O fluido do lavado broncoalveolar (FLBA);

B. Número de células apresentadoras de antígenos (FOXP3) e células dendríticas

C. Número de linfócitos CD4+ e CD8+;

D. A expressão celular de citocinas pró-inflamatórias (TNF- alfa e IL-6), anti-inflamatórias (IL-10) e linfocinas (IL-2, IL-4, IL-5, IL- 13 e IL-17) e quimiocina (TARC);

E. Quantificação de IL-6 por RT-PCR:

F. Elementos da matriz extracelular:

a. Fração de volume de fibras colágenas (tipo I e III), actina, decorina, biglicano, lumicam, fibronectina e integrina;

b. Expressão celular de MMP-9, MMP-12 e TIMP-1 e TGF-beta

G. Resposta das vias de estresse oxidativo: expressão celular de INOS e fração de volume isoprostano PGF-2α;

H. Expressão celular de NF-kB,

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MATERIAIS E