3. Objetivo Geral.
Investigar os mecanismos moleculares envolvidos no desenvolvimento da resistência à
insulina, inflamação, esteatose hepática e hepatomegalia associados à lipodistrofia severa
promovida pela deleção de pparγ especifica em adipócitos.
3.1 Objetivos específicos
Investigar em camundongos com lipodistrofia severa:
1. Caracterizar as alterações temporais na homeostase da glicose e morfologia, inflamação
e metabolismo hepática;
2. Identificar e caracterizar o possível mecanismo responsável pelas alterações hepáticas;
3. Investigar os efeitos da inibição farmacológica da enzima FAS na homeostase da
glicose, morfologia, inflamação e metabolismo hepático;
4. Investigar os efeitos da inibição nutricional do processo de lipogênese de novo pela
ingestão de dieta rica em ácidos graxos ômega 3 na homeostase da glicose, morfologia,
inflamação e metabolismo hepático;
31
4. Hipóteses testadas
1- A lipodistrofia severa está associada a alterações temporais na homeostase da glicose e
morfologia, inflamação e metabolismo hepática em camundongos;
2- A inibição farmacológica da FAS e assim da lipogênese de novo reduz a resistência à
insulina, esteatose hepática e hepatomegalia em camundongos com lipodistrofia severa.
3- A ingestão de dieta rica em ácidos graxos poli-insaturados do tipo ômega 3 reduz a
resistência à insulina, esteatose hepática e hepatomegalia em camundongos com
lipodistrofia severa.
32
5. Materiais e métodos
5.1 Animais e dietas.
Todos os procedimentos realizados com animais seguiram os princípios éticos de
experimentação animal e foram previamente aprovados pelo Comissão de Ética no Uso de
Animais (CEUA) do Instituto de Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo,
Protocolos 098 e 115 e normas estabelecidas pelo CONCEA foram mantidos no Biotério do
departamento de Fisiologia e Biofisica.
Para a produção de camundongos com lipodistrofia severa e controles, utilizou-se o
sistema Cre-lox para promover a deleção específica de PPARγ em adipócitos (AT-PPARγ).
Para isto, camundongos PPARγ floxeados B6.129-PPARγ
tm2Rev/j(PPARγ lox) e camundongos
que expressam a enzima Cre recombinase sob o controle do promotor da adiponectina
B6;FVB-Tg(Adipoq-cre)1Evdr/J (The Jackson Laboratory, Bar Harbor, Maine, EUA) foram cruzados.
Animais heterozigotos para PPARγ flox e positivos para adiponectina-Cre oriundos deste
primeiro cruzamento foram cruzados com animais homozigotos para PPARγ flox. Deste
segundo cruzamento, camundongos homozigotos para PPARγ flox e positivos para
adiponectina-Cre denominados de AT-PPARγ KO e camundongos homozigotos para PPARγ
flox e negativos para adiponectina-Cre denominados de AT-PPARγ WT (controles) foram
utilizados nos experimentos. Como a proporção de animais com o genótipo desejado
produzidos a partir deste cruzamento é muito baixa, realizou-se um terceiro cruzamento entre
camundongos homozigotos para PPARγ flox e positivos para adiponectina-Cre (lipodistróficos)
e camundongos PPARγ flox. Descobriu-se que tanto os camundongos machos quanto fêmeas
com lipodistrofia severa eram inférteis, um problema que foi superado pelo transplante
subcutâneo de tecido adiposo nestes animais.
Camundongos AT-PPARγ WT e AT-PPARγ KO foram mantidos em biotério à 23°C
com ciclo claro/escuro de 12 horas, ração e água ad libitum. Foram realizados 3 protocolos
distintos. No protocolo 1, camundongos AT-PPARγ WT e AT-PPARγ KO com idade de 6, 12
e 24 semanas, alimentados com ração comercial padrão Nuvilab CR-1 (Nuvital, Paraná, Brasil)
e acomodados individualmente. Foram avaliados para diversos parâmetros, anestesiados com
isoflurano e mortos por deslocamento cervical após coleta de sangue por punção cardíaca. No
protocolo 2, camundongos AT-PPARγ WT e AT-PPARγ KO com 6 semanas de idade foram
acomodados em caixas coletivas com numero máximo de 3 animais por caixa e alimentados
33
com ração comercial padrão Nuvilab CR-1 (Nuvital, Paraná, Brasil) foram tratados com o
inibidor farmacológico Fasnall na dose de 15 mg/kg de peso corporal (ALWARAWRAH et al.,
2016). O Fasnall foi dissolvido em solução de DMSO (20% em salina 0,9% estéril) e
administrado via injeção intraperitoneal duas vezes por semana por 5 semanas. Os animais
controles receberam injeção intraperitoneal de DMSO (20% em salina 0,9% estéril). Após
término do tratamento, camundongos anestesiados com isoflurano e eutanasiados por
deslocamento cervical após coleta de sangue por punção cardíaca e tecidos. No protocolo 3,
camundongos AT-PPARγ WT e AT-PPARγ KO com 12 semanas de idade foram acomodados
em caixas coletivas com numero máximo de 3 animais por caixa submetidos a um protocolo
alimentar com ração comercial padrão Nuvilab CR-1 (Nuvital, Paraná, Brasil) ou duas dietas
hiperlipídicas isocalóricas (20% carboidratos, 20% proteínas e 60% lipídeos, kcal) produzidas
usando banha de porco (HF) ou óleo de peixe (HFω-3 ) como fonte de lipídeos por 5 semanas,
anestesiados com isoflurano e mortos por deslocamento cervical após coleta de sangue por
punção cardíaca. A composição de macronutrientes e ácidos graxos das dietas hiperlipídicas
estão detalhadas nas Tabelas 1 e 2. Nos 3 protocolos realizados foram utilizados apenas
camundongos machos.
Tabela 1. Composição das dietas hiperlipídicas
Componentes HF HFω-3
g/kg
Caseína 258.4 258.4
L-Cistina 3.9 3.9
Amido milho dextrinizado 161.5 161.5
Sacarose 88.9 88.9
Celulose 74.1 74.1
Óleo de soja 32.3 32.3
Banha 316.6 0
34
Mix Mineral AIN93M 47.9 47.9
Mix Vitamina AIN93M 13.7 13.7
Bitartarato de Colina 2.6 2.6
Kcal (%)
Proteína 20 20
Carboidratos 20 20
Gordura 60 60
Tabela 2 Composição de ácidos graxos das dietas hiperlipídicas.
Valores são expressos em mg/g. nd, não detectado.
HF HFω-3 C14:0 4 23 C14:1 nd nd C16:0 73 60 C16:1 6 27 C17:1 nd 1 C18:0 37 12 C18:1 128 38 C18:2ω-6 65 21 C18:3ω-3 4 4 C20:0 1 1 C20:1n-9 3 4 C20:2ω-6 2 1 C20:3ω-6 nd 1 C20:4ω-6 nd 3 C20:5ω-3 nd 47 C22:0 nd 1 C22:1n-9 nd 2 C22:6ω-3 nd 29 C24:1 nd nd Total saturado 120 106 Total monoinsaturado 143 82 Total poliinsaturado ω-6 66 25 Total poliinsaturado ω-3 4 80
35
5.2 Genotipagem.
Aproximadamente 0,2 cm da cauda foi cortada após anestesia com isoflurano. A
extração do DNA caudal foi realizada por digestão por NaOH 50 mM por 12 minutos à 95ºC,
seguido de neutralização com 1M Tris-HCl (pH 6,8) e centrifugação por 15 min à 13.000 rpm.
Foi utilizado o sobrenadante para reação de PCR com o kit Platinum Taq DNA Polymerase
(Life Technologies, EUA). Os primers utilizados para genotipagem do PPARγLox/Lox foram:
forward TGT AAT GGA AAG GCA AAA GG e reverse TGG CTT CCA GTG CAT AAG TT,
sendo que a presença de apenas uma banda de tamanho 200 pares de base (bp) caracteriza o
genótipo selvagem, enquanto que a presença de apenas uma banda de 230 bp caracteriza o
genótipo mutante (PPARγLox/Lox), e a presença de ambas bandas caracteriza o heterozigoto
PPARγLox/WT. Para amplificação do adiponectina-cre foram utilizados os seguintes primers:
CTAGGCCACAGAATTGAAAGATCT, GTAGGTGGAAATTCTAGCATCATCC,
ACGCGTTAATGGCTAATCGC e GGCGCTAAGGATGACTCTGG sendo que a banda de
tamanho 324 bp é referente ao controle interno da reação e a banda de tamanho 225 bp ao
transgene adiponectina-cre, quando presente. As amostras foram corridas em gel de agarose 2%
para a separação dos produtos de PCR.
5.3 Eficiência energética.
Durante o todo o experimento, o consumo de ração e o peso corporal dos animais foram
avaliados semanalmente. A eficiência energética foi calculada como o ganho de peso de cada
animal em gramas durante todo o protocolo divido pelo consumo total de ração em kcal.
5.4 Calorimetria indireta.
Camundongos AT-PPARγ WT e AT-PPARγ KO foram colocados em gaiolas
metabólicas individuais por um dia para adaptação. Em seguida, as medidas de consumo de
oxigênio (VO2), produção de gás carbônico (CO2) e atividade motora espontânea foram
realizadas durante 24 horas pelo Comprehensive Laboratory Monitoring System (Columbus
Instruments, Columbus, OH, EUA), um calorímetro de circuito aberto integrado, equipado com
um sistema de monitoramento de atividade por feixes ópticos. A contagem da atividade motora
foi calculada somando o número de feixes atingidos nos eixos x, y e z. O quociente respiratório
foi calculado como a razão VO2/CO2.
36
5.5 Teste intraperitoneal de tolerância à glicose.
Camundongos jejuados na parte da manhã por 6 horas e após o período de jejum,
receberam injeção intraperitoneal de glicose (1 g/kg de peso). O sangue da cauda foi coletado
e a glicemia foi aferida antes e 15, 30, 45, 60 e 90 minutos após a injeção de glicose com o
auxílio de glicosímetro (OneTouch Johnson & Johnson). Foi calculada a área sob a curva
(AUC) durante o teste tendo como baseline o valor da glicemia antes da administração de
glicose.
5.6 Parâmetros séricos.
Após 12h de jejum durante o período noturno, os animais foram anestesiados, o sangue
foi coletado por punção cardíaca e centrifugado por 15 minutos a 1.500 rpm para separação do
soro. A concentração sérica de glicose, triacilglicerol e colesterol, bem como as atividades
plasmáticas de alanina transaminase (ALT) e aspartato transaminase (AST), utilizadas como
marcadores de lesão hepática, foram determinadas por meio de kits comerciais (Labtest, Lagoa
Santa, MG, Brasil). A concentração de insulina plasmática foi determinada por kit especifico
de ELISA (Enzyme-linked Immunosorbent Assay) (R&D Systems, EUA).
5.7 Extração e quantificação de lipídeos.
Fragmentos do fígado foram homogeneizados em 1,5 mL de clorofórmio-metanol 2:1
(v/v), seguido da adição de 250 μL de água. Após separação das fases por centrifugação à 3.000
rpm por 5 minutos, a fase superior foi descartada e a fase inferior evaporada e re-suspensa em
isopropanol para a dosagem de triacilglicerol por kit enzimático (Labtest, Lagoa Santa, MG,
Brasil).
5.8 Extração e quantificação de glicogênio.
O conteúdo hepático de glicogênio foi quantificado pelo método de Van Handel (1965)
pela quantificação da glicose após hidrólise ácida do glicogênio e neutralização. Pequenas
porções do fígado foram foi pesadas, colocadas em tubos cônicos com KOH 30% e aquecidas
por 60 minutos à 100ºC. Em sequência foram adicionados Na
2SO
4e álcool etílico e as amostras
foram agitadas em vórtex e centrifugadas à 3.000 rpm por 10 minutos. O pellet formado foi
lavado com água à 90°C e álcool etílico, sendo este procedimento repetido por 3 vezes.
Posteriormente, o pellet foi dissolvido em 500 µL de água e acrescentado 500 µL de HCl 4N.
As amostras foram aquecidas em banho-maria por aproximadamente 60 minutos à 100°C.
37
Posteriormente, após resfriamento das amostras, estas receberam 500 µL de Na
2CO
32M. Uma
alíquota de 10 µL desta mistura foi utilizada para a medida da glicose com o kit da Labtest),
seguindo as recomendações do fabricante.
5.9 Extração e quantificação de DNA.
O DNA foi extraído do tecido hepático utilizando o kit IllustraTM tissue and cells
genomicPrep Mini Spin Kit (GE Healthcare, Buckinghamshire, Reino Unido) e quantificado
por PCR quantitativo em tempo real (qPCR) usando primers para Rpl13 genômico (forward:
GAGATTGGCCGGACTCCCTA e reverse: GATGGACCACGATGGGACC) e uma curva
padrão de concentração de DNA conhecida.
5.10 Análise histopatológica e imunoistoquímica hepática.
As amostras de tecido hepático foram fixadas por imersão em paraformaldeído a 4% ou
solução fixadora de Bouin (solução saturada de ácido pícrico a 75%, formaldeído a 25%, ácido
acético glacial a 10%, [v/v]) e embebidas em parafina. As amostras de fígado foram cortadas
em secções de 5 µm e coradas com hematoxilina e eosina (H & E) para avaliar a morfologia
geral do fígado, ácido periódico-Schiff (PAS) para detectar glicogênio e Sirius Red para
detectar colágeno fibrilar e fibrose hepática. A análise histopatológica hepática foi realizada
utilizando um sistema de pontuação NAFLD previamente definido para roedores (LIANG et
al., 2014).
Para imunodetecção de PCNA, secções fixadas em paraformaldeído a 4% foram
desparafinadas, lavadas em solução salina tamponada com fosfato 0,1 M com 0,03% (v / v) de
Tween 20 (PBS-T, pH 7,2) e tratadas com 3% (v / v ) peróxido de hidrogênio em PBS por 30
minutos em temperatura ambiente para bloquear a peroxidase endógena. A recuperação do
epítopo induzida pelo calor foi realizada a 96 ° C por 60 minutos usando tampão citrato de
sódio (10 mM de citrato de sódio, 0,05% [v/v] Tween 20, pH 6,0), e locais não específicos
foram bloqueados usando soro de cabra em PBS -T 1:1 (v/v). As secções foram incubadas com
anticorpo anti-PCNA de coelho (ab18197, Abcam, Cambridge, USA) durante a noite a 4 ° C e
com anticorpo secundário IgG anti-coelho de cabra conjugado a HRP (5220-0283 KPL,
Milford, EUA) durante 1 hora temperatura do quarto. A imunorreacção foi desenvolvida com
3,3'-diaminobenzidina (DAB) a 0,03% (v/v) em PBS e contrastada com a hematoxilina de
Meyer. O índice mitótico foi calculado como o número de núcleos positivos para PCNA por
1000 núcleos de hepatócitos.
38
5.11 Conteúdo de citocinas hepáticas.
Conteúdo de citocinas hepáticas. Fígado (100 mg) foi homogeneizado em 800 μL de
tampão de extração. A concentração de proteína foi determinada no sobrenadante pelo método
de Bradford (5) (Bio-Rad, Hercules, Califórnia) com albumina de soro bovino como referência.
A avaliação quantitativa do conteúdo de interleucina (IL) -1β e IL-6 do fator de necrose tumoral
(TNF) -α foi realizada por ELISA (DuoSet ELISA, R & D Systems, Minneapolis, MN, EUA)
seguindo as recomendações do fabricante.
5.12 Extração de rna e transcrição reversa.
Para extração de RNA, aproximadamente 50 mg de tecido adiposo foi homogeneizado
com 1 mL Trizol Reagent (Life Technologies, USA), seguido da adição de 0,2 mL clorofórmio,
agitação por 15 segundos e centrifugação a 12000 g por 15 minutos a 4 °C. Após separação da
fase superior aquosa, foi adicionado 0,5 mL de 100% isopropanol, seguido de incubação à
temperatura ambiente por 10 minutos e centrifugação a 12000 g por 15 minutos a 4 °C. O pellet
de RNA foi então lavado com 75% etanol e centrifugado a 7500 g por 5 minutos. O pellet de
RNA foi ressuspendido em água isenta de RNase e quantificado em espectrofotômetro
Nanodrop 2000 (Thermo Scientific, USA) a 260 nm. Para a reação de transcrição reversa, foram
incubados a 65 °C por 5 minutos a mistura de 1 μg de RNA total diluído em água isenta de
RNase totalizando 12 μL, 1 μL 10 mM dNTP e 1 μL 50 μM oligo-dT. Em seguida, foram
adicionados 4 μL 5X First Strand Buffer, 1 μL 0,1 M DTT e 1 μL Superscript III reverse
transcriptase (200 U/μL) (Life Technologies, USA). Seguiu-se com a incubação a 50 °C por 1
hora, 70 °C por 15 minutos e 4 °C por 10 minutos. O cDNA resultante foi então diluído 25
vezes em água isenta de RNase e estocado a -20 °C.
5.13 Pcr em tempo real
O PCR em tempo real foi utilizado para quantificação dos níveis de RNAm de
proteínas de interesse e de DNA. Para cada reação de PCR, foram utilizados 3 μL cDNA ou
DNA, 2,74 μL água isenta de RNase, 3,93 μL SYBR Green (Sigma-Aldrich) e 0,33 μL mistura
de primer forward e reverse a 5 μM. As amostras foram então incubadas em PCR RotorGene
(Qiagen) por 40 ciclos, seguido de melting. A análise da expressão gênica foi realizada por
quantificação relativa pelo método de CT comparativo (ΔΔCt). Os dados foram apresentados
como a razão entre o gene alvo e o gene de referência (36b4), cujo valor não foi encontrado
39
alterado nos diversos tratamentos utilizados. Os primers utilizados para esta análise estão na
Tabela 3.
Tabela 3 Primers utilizados no PCR em tempo real.
Gene NCBI GenBank Forward (5' - 3') Reverse (3'-5')
36B4 NM_007475.5 CCACTTACTGAAAAGGTCAAGGC TGGTTGCTTTGGCGGGATTTA
F4/80 NM_010130.4 GCCACGGGGCTATGGGATGC TCCCGTACCTGACGGTTGAGCA
CD86 NM_019388.3 CCCAGCAACACAGCCTCTAA ACTCTGCATTTGGTTTTGCTGA
CD206 NM_008625.2 ATGCCTTCGAATGGGTGCC GAGGGATCGCCTGTTTTCCA
Clec4f NM_016751.3 CGTCCAGGTCATTCTGGCAT TGGGAATGATTGTCGTGTCCA
Col1a1 NM_007742.4 ATCCCTGAAGTCAGCTGCATA TGGGACAGTC CAGTTCTTCAT
Pdgfrb NM_008809.2 ACTACATCTCCAAAGGCAGCACCT TGTAGAACTGGTCGTTCATGGGCA
Tgfb1 NM_011577.2 TGACGTCACTGGAGTTGTACGG GGTTCATGTCATGGATGGTGC
Timp1 NM_001044384.1 CAGTAAGGCCTGTAGCTGTGC CTCGTTGATTTCTGGGGAAC
5.14 Western blotting.
O tecido hepático foi homogeneizado em tampão contendo, em mmol/L: 50 HEPES, 40
NaCl, 50 NaF, 2 EDTA, 10 pirofosfato de sódio, 10 glicerofosfato de sódio, 2 ortovanadato de
sódio, 1% Triton-X 100 e inibidor de proteases livre de EDTA. As amostras foram
centrifugadas a 13.000 rpm por 10 min a 4ºC e o sobrenadante foi retirado para quantificação
de proteínas pelo método de Bradford. Após mistura com tampão contendo 20% SDS,
mercaptoetanol, glicerol, Tris-HCl, e azul de bromofenol, pH 6.8, 30 μg de proteína total foram
separadas em gel SDS-PAGE (12%) e transferidas para membranas de PVDF. Após uma hora
de bloqueio em leite livre de gordura (5%), as membranas foram incubadas overnight com os
seguintes anticorpos primários: NFκB p65, NFκB p65 fosforilado (p), Akt, pAkt (S473), S6,
pS6, PKC-θ, SCD1, FAS, ACC1, GAPDH e IL-1Cell Signalling Technology, Beverly, MA,
EUA) diluídos 1:1000 em albumina sérica bovina (BSA) a 5%. Após lavagem e incubação com
anticorpo secundário (1:10000), as proteínas foram reveladas com ECL (GE Healthcare Life
Sciences).
40
5.15 Análise dos ácidos graxos por cromatografia gasosa
A análise de constituição lipídica do fígado foi feito pela técnica de éster metílico de
ácidos graxos (FAME) (MASOOD; STARK; SALEM, 2005). Brevemente, lipídeos das dietas
foram extraídos com clorofórmio:metanol (2:1). Posteriormente a fração clorofórmio foi
misturada com metanol (1,76 mL), ácido margárico 1 mg/mL (50 μL), cloreto de acetila (100
μL) e aquecido a 100
oC por 60 minutos. Após o resfriamento, foi adicionado hexano (1,5 mL)
e os tubos foram agitados vigorosamente e centrifugados a 1.500 x g por 2 minutos a 4
oC. A
fase orgânica superior foi coletada e evaporada sob nitrogênio líquido e o resíduo foi dissolvido
em 40 L de hexano. 1 μL das amostras foi injetado individualmente em um cromatógrafo a
gás (Trace 1310 – Thermo Scientific) com detector de ionização em chama, usando uma coluna
capilar (DB-FFAP, 15 m × 0.1 mm id × 0.1 um, Agilent Technologies). Éster metílico de ácidos
graxos (FAME) foi identificado pela comparação direta com FAME standard mix (Supelco 37
Component FAME Mix; Sigma-Aldrich), individualmente os picos foram integrados e
normalizados pelo padrão interno. A porcentagem de FAME individual foi calculada em
relação à área total dos picos.
6. Proteômica quantitativa.
6.1 Preparo dos extratos protéicos e digestão em solução por tripsina.
Amostras de 100 mg de tecido hepático foram homogenizadas em tampão Tris-Ureia
(50 mM Tris pH 8.1, 75 mM NaCl e 8M Ureia), centrifugadas a 20.000 x g por 15 minutos a
4ºC. O conteúdo proteico do sobrenadante foi quantificado pelo método de Bradford.
Posteriormente, 100 µg de proteínas foram precipitadas com acetona na proporção 4:1 (vol:vol),
após incubação a -30ºC por 2 h e centrifugação a 14.000 rpm por 10 minutos a 4
oC. As proteínas
precipitadas foram dissolvidas em 20 L de 8 M uréia, avaliadas para o pH e reduzidas com 0,5
µL de ditiotreitol 1M sob agitação por 30 minutos a 37
oC. Após redução, amostras foram
alquiladas pela adição de 5 L de iodoacetamida 200 mM por 30 minutos à temperatura
ambiente no escuro. O quenching da reação de iodoacetamida livre foi feita através da adição
de 2 uL de ditiotreitol 1M e posterior incubação por 15 minutos à temperatura ambiente
protegido da luz. Após essa etapa, as amostras foram diluídas na proporção 1:5 em 50 mM de
NH
4HCO
3para reduzir a concentração de ureia para 1,6 M e digeridas com tripsina (Promega)
41
dessalinizadas em colunas do tipo OASIS (Waters), evaporadas em speed vac e estocadas a
-20
oC até a análise por espectrometria de massas.
6.2 Espectrometria de massas.
50 µg do extrato protéico de cada amostra foi analisada na coluna cromatográfica
EASY-nLC (Thermo Scientific, Waltham, MA, EUA) em tandem com o espectrômetro
LTQ-Orbitrap Velos (Thermo Scientific). Os peptídeos foram separados utilizando gradiente de 120
minutos consistindo de 90 minutos de separação em 5-40% do solvente B (90% acetonitrila em
0,1% ácido fórmico); 20 minutos em 40-90% do solvente B com razão de fluxo de 200 nL/min,
utilizando uma pré-coluna empacotada com C18, tamanho de 5 cm, porosidade de 10 µm
(Jupiter, Phenomenex) e capilaridade de ID 100 µm x OD 360 µm e uma coluna analítica do
tipo “fritted tip” empacotada com C18, tamanho de 15 cm e porosidade de 5µm (Aqua
Phenomenex) e capilaridade de ID 75µm x OD 360µm. A voltagem do “nanoelectrospray” foi
ajustada para 2,3 kVw a fonte de temperatura para 250
oC. O espectrômetro de massas foi
operado no modo de aquisição dependente de dados (Data Dependente Acquisition – DDA),
onde os 10 íons precursores mais abundantes foram selecionados para a fragmentação por
dissociação induzida por colisão (Collision Induced Dissociation – CID), sendo que o espectro
de massas (MS) “full-scan” foi seguido pela espectrometria de massas em tandem (MS/MS)
com a CID ajustada em 35% da energia por informação de sequência dos 10 íons precursores
mais abundantes em cada ciclo. O tempo de injeção do “ion trap” foi de 100 ms e o tempo de
injeção FT-MS foi ajustado a 1000 ms com uma resolução de 60.000 através de uma razão
carga por massa (m/z) de 300-800. Para os “IT scans”, a fragmentação foi feita sobre os íons
abaixo do limiar de 500 contagens e a exclusão dinâmica foi habilitada com uma lista de
exclusão de tamanho de 500 a 70 segundos, repetida na duração de 30 segundos e uma contagem
de repetição de 1.
6.3 Análises dos espectros.
Os espectros de massas (raw data) foram processados utilizando o programa MaxQuant
v1.5.0.0 (COX; MANN, 2008), utilizando o parâmetro LFQ (Label Free Quantification), para
a quantificação dos íon precursores mais intensos. A busca no banco de dados, foi também
realizada no programa MaxQuant utilizado o arquivo FASTA da versão de Janeiro de 2016 do
42
A taxa de falsos positivos (False Discoverer Rate –FDR) foi de 0.01 para proteínas e peptídeos
(PSM – peptide sequence match) e um mínimo de 7 aminoácidos por sequência de peptídeos.
A tolerância de massa foi de 4,5 ppm para os íons precursores e de 20 ppm para os fragmentos
dos íons. Oxidação da metionina e N-acetilação foram assumidas como modificações fixase
carbamidometil como modificação variável. No arquivo final do MaxQuant está mostrado a
intensidade log2 KO/WT, números de acesso, % de cobertura das sequências das proteínas,
score, MS/MS count e a diferença do teste. Análise estatística foi realizada com o software
Perseus (v1.5.0.8) (TYANOVA et al., 2016), através de um test t student não pareado para duas
amostras (KO versus WT). Para proteínas com p<0.05, foram gerados gráficos de Hierarchical
clusters (heatmap) e Volcano plot. A análise da função das proteínas, componentes celulares e
processos biológicos, das proteínas identificadas com quantificação significativa foram
realizados utilizando o Gene Ontology (GO), contido no software “Funrich” (PATHAN et al.,
2015). O enriquecimento de vias bioquímicas foi calculado utilizando o software String10
(https://string-db.org/). A análise das vias metabólicas mais importantes foi feita através do
banco KEGG (Kyoto Encyclopedia of Gene and Genomes – http://www.genome.jp/kegg/).
7. Análise estatística
Os valores estão apresentados como média ± erro padrão da média. Para a comparação
entre os genótipos, foi utilizado Teste t de Student não pareado. Quando mais de dois grupos
foram comparados (no caso do tratamento dos animais com drogas), foi utilizada análise de
variância de duas vias (ANOVA two-way) com pós-teste de Newman-Keuls. Estabelecemos
um nível de significância de 5%, ou seja, os resultados só foram considerados estatisticamente
diferentes quando p < 0,05. Os dados foram analisados no programa Graph Prism 7.0®
(GraphPad Software Inc, San Diego, CA, EUA). Na legenda das figuras, n significa o número
43
8. Resultados
8.1 Estudo 1: Caracterização do modelo experimental de lipodistrofia induzida por
deleção de PPARγ exclusivamente em adipócitos.
A deleção específica de PPARγ em adipócitos foi confirmada pela genotipagem dos
camundongos identificando homozigose para PPARγ floxeado (PPARγ
lox/lox) e presença da
enzima Cre recombinase (Figura 1A), bem como, pela total ausência de adiponectina circulante
(Figura 1B) e de tecido adiposo (Figura 1C). Como pode ser observado na Figura 1C,
camundongos AT-PPARγ KO, apresentaram a lipodistrofia severa (flechas amarelas) e,
consequentemente, hepatomegalia (flechas verdes).
Figura 1 - A. Gel de agarose típico de genotipagem de camundongos para a identificação da
enzima CRE recombinase e PPARγ floxeado; B. Níveis séricos de adiponectina. C. Foto
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RAFAEL JUNGES MOREIRA
(páginas 32-142)