55 A dentinogénese é um processo contínuo de deposição de matriz dentinária ao longo da vida do dente. A formação do tecido dentinário tem início quando se atinge o estágio de desenvolvimento de campânula. Nesta fase, a papila dentária está bem definida, juntamente com o epitélio interno do esmalte já diferenciado e preparado para secretar a matriz de esmalte. No início da dentinogénese a papila dentária passa a ser designada de polpa dentária que, embora seja um processo contínuo durante toda a vida, se subdivide em diferentes estádios: a diferenciação das células formadoras de dentina - os odontoblastos; a deposição da matriz orgânica - a pré-dentina; e a mineralização e modificação ao longo do tempo dessa matriz (Simon
et al., 2009).
Os odontoblastos derivam de células do tecido conjuntivo embrionário, designadas por células ectomesenquimatosas devido à sua origem, bem estabelecida, da crista neural. As células da crista neural migram precocemente para formar uma população na região do primeiro arco branquial ou faríngeo, formando um ectomesênquima que dá origem a todos os tecidos conjuntivos laxos e duros crânio-faciais (Arana-Chavez e Massa, 2004). Inicialmente, o epitélio oral primitivo espessa-se e prolifera no ectomesênquima subjacente, sofrendo uma condensação celular e estabelecendo-se a papila dentária. Uma série de interações epitélio- ectomesenquimatosas, reguladas e recíprocas, são responsáveis pelo início da formação do dente. Quando a odontogênese começa, embora a sinalização continue, a proliferação de células epiteliais é um evento que ocorre nos estádios de botão, de campânula e de sino. A diferenciação dos odontoblastos começa na extremidade das futuras cúspides, mas apenas depois do germem do dente ter atingido o estádio de sino e a forma da coroa ter sido estabelecida. As células ectomesenquimatosas da papila dental exibem uma relação núcleo/citoplasma elevada,
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possuem vários processos curtos e contêm polirribossomas relativamente abundantes, mas o retículo endoplasmático rugoso (RER), o aparelho de Golgi e as mitocôndrias são raros. As moléculas de sinalização surgem nas células epiteliais assim que iniciam a sua diferenciação em ameloblastos, possivelmente modificando a lâmina basal interna para induzir as células externas pós-mitóticas da papila dentária a se diferenciar em odontoblastos. Os odontoblastos diferenciadores iniciam a secreção da dentina antes do início da secreção da matriz do esmalte pelos ameloblastos (Arana-Chavez e Massa, 2004; Niño-Barrera, Gutiérrez e Garzón-Alvarado, 2013; Srisuwan et al., 2012).
As células formadoras de dentina, os odontoblastos são, pois, células pós-mitóticas altamente diferenciadas, capazes de secretar componentes da matriz dentinária primária, secundária e terciária (Murray et al., 2003). Como já referido, a diferenciação morfológica dos odontoblastos tem início nas células da papila dentária adjacentes à membrana basal do epitélio interno do esmalte, logo abaixo do que virão a ser as cúspides ou os bordos incisais. Inicialmente, estas células pré-odontoblásticas não têm organelos bem desenvolvidos nem uma organização específica. Modificações na composição da membrana basal do esmalte limitadas no tempo, ocorrem simultaneamente com a diferenciação dos odontoblastos. De entre elas podemos referir a expressão e localização da laminina, os proteoglicanos contendo condroitina, as proteínas do esmalte e a presença de fibronectina e de decorina no polo distal das células, bem como a presença de fatores de crescimento como o TGF, o IGF (do inglês, insulin-like growth factor) e o BMP (Melin et al., 2000; Srisuwan et al., 2012; Tonomura et al., 2007). Sob estes estímulos ocorre uma hipertrofia celular, com alongamento da célula, dando-lhe uma forma cilíndrica. Simultaneamente, ocorre a polarização celular com deslocamento do núcleo para a parte basal, oposta ao epitélio interno do esmalte, juntamente com o aumento de tamanho dos organelos de síntese, nomeadamente o aparelho de Golgi e o retículo endoplasmático rugoso. O aparelho de Golgi fica na região supranuclear, enquanto que o retículo endoplasmático rugoso ocupa a maior parte do citoplasma distal. Este alongamento e polarização das células é acompanhado por uma redistribuição de proteínas como a actina, a vinculina e a vimentina do esqueleto intracelular, bem como a expressão da nestina e da citoqueratina. Além disto, também ocorrem alterações na membrana das células, como o aumento da expressão de
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57 proteínas que se ligam à fibronectina. Nesta fase, muitos processos celulares pequenos iniciam a sua formação em direção à membrana basal do epitélio interno do esmalte. No entanto, à medida que a diferenciação evolui, o número de processos odontoblásticos reduz-se, ficando apenas o maior. As junções celulares, particularmente entre odontoblastos, mas também entre odontoblastos e células pré-odontoblásticas aumentam em número. Estas junções podem ser célula a célula, oclusivas, comunicantes ou mácula aderente como já referido atrás (Arana- Chavez e Massa, 2004; Bleicher, 2014; Garant, 2003).
Dentinogénese primária
Quando os odontoblastos estão completamente diferenciados, começam a secretar a sua matriz orgânica (4-20 µm/dia), constituída por diversos elementos, nomeadamente, fibras de
colagénio, proteoglicanos, glicoproteínas e sialoproteínas, fosfoproteínas, fatores de crescimento e lípidos (Bleicher, 2014). O elemento mais abundante da matriz dentinária é o colagénio do tipo I, seguido pela fosfoproteína da dentina, DPP, sendo esta última, juntamente com a DSP, exclusivas do tecido dentinário e com um papel significativo na mineralização do mesmo. As fibras de colagénio do tipo I são secretadas, numa fase inicial, pelo corpo do odontoblasto e depositadas perpendiculares à futura junção amelodentinária (Couble et al., 2000; Simon et al., 2009; Yamamoto, Oida e Yamakoshi, 2015). Uma vez depositada a camada inicial do manto, a dentina circumpulpar primária é depositada num padrão incremental regular. Para além da deposição de colagénio, o processo odontoblástico secreta outras proteínas não colagénicas, como a fosforina, que se liga ao colagénio em ligações altamente específicas com as fibrilhas das gap junctions (Arana-Chavez e Massa, 2004; Larmas e Sándor, 2014). Após a formação do manto de dentina, o colagénio do tipo I remanescente é depositado com as fibras paralelas à linha pulpodentinária. A deposição da nova matriz ocorre a um ritmo semelhante ao da mineralização, de tal forma que existe sempre uma camada não mineralizada, a pré-dentina na superfície pulpar do tecido dentinário. A mineralização da dentina é um processo totalmente dependente dos odontoblastos, e só ocorre na sua presença. São eles que controlam o transporte e a libertação de iões cálcio e determinam a presença e a distribuição dos componentes da
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matriz que podem iniciar e modular o processo. Assim, a mineralização inicia-se com o transporte ativo de iões cálcio para o local da mineralização, que se acumulam inicialmente na porção distal do processo e se ligam a vários organelos. O cálcio transportado pelos odontoblastos torna-se, na dentina, num mineral cristalino por deposição sob um substrato formado por fibrilhas de colagénio do tipo I. Este processo é controlado pela proteína não colagénica predominante na dentina, a DPP (Couble et al., 2000).A DPPé aniónica pelo que se liga facilmente ao cálcio. Esta proteína tem a capacidade de se alterar estruturalmente, o que permite a ligação crescente de iões cálcio com formação, crescimento e estabilização da unidade mineralizada do tecido dentinário. Por outro lado, em grandes concentrações, a DPP inibe a formação do cristal. Assim, através do controlo da libertação e da concentração da DPP, o odontoblasto controla a fase inicial da mineralização assim como a taxa de deposição (Niño- Barrera, Gutiérrez e Garzón-Alvarado, 2013). Além desta proteína existem outras que participam no processo de mineralização tais como: as proteínas não colagenosas (do inglês
small integrin-binding ligand N-linked glycoproteins – SIBLINGs) como a osteopontina (do inglês
osteopontin - OPN), a DSP e a DMP-1; a osteonectina (do inglês osteonectin – ON) e a fosfoglicoproteína da matriz extracelular (do inglês matrix extracelular phosphoglycoprotein – MEPE); e os proteoglicanos pequenos ricos em leucina (do inglês small leucine-rich proteoglycan
– SLRP) como o biglicano, a decorina, a fibromodulina, o lumican e a osteoaderina (Bleicher, 2014; Simon et al., 2009; Yamamoto, Oida e Yamakoshi, 2015; Zurick, Qin e Bernards, 2013). A osteonectina, é uma proteína fosforilada produzida pelo odontoblasto que inibe o crescimento dos cristais de hidroxiapatite e que promove a ligação do cálcio e do fosfato ao colagénio. A osteopontina é também uma proteína fosforilada capaz de promover a formação mineral na dentina, tal como a sialoproteína presente no processo inicial de mineralização da dentina, e na dentina peritubular (Arana-Chavez e Massa, 2004; Couble et al., 2000; Niño-Barrera, Gutiérrez e Garzón-Alvarado, 2013; Smith et al., 2012). Existem, ainda, outros processos envolvidos na fase inicial da mineralização como a nucleação mediada pela DPP sobre as fibrilhas colagénicas. À medida que o processo odontoblástico se retrai, alguns restos celulares permanecem localmente e formam“vesículas matriciais”, nas quais se forma o manto de dentina. Além disso, ocorre no seu interior a formação de organelos cuja membrana contem várias enzimas,
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59 nomeadamente a fosfatase alcalina (do inglês alkaline phosphatase – ALP). Esta enzima, em particular, eleva a concentração de iões fosfato dentro da vesícula, o que leva à formação de cristais minerais. Estas estruturas cristalinas apenas estão presentes, muito precocemente na formação do manto de dentina. A deposição da matriz e a mineralização ocorrem continuamente havendo, na frente de mineralização, padrões irregulares, em especial áreas onde a mineralização progride de uma forma linear, outras em forma de esferas (calcosferritos) que eventualmente se fundem, enquanto outras mostram uma combinação das duas. Os vários padrões de mineralização são comuns em toda a dentina (Berkovitz, Holland e Moxham, 2004; Bleicher, 2014; Larmas e Sándor, 2014).
Dentinogénese secundária ou fisiológica
Após a secreção da maior parte da dentina circumpulpal durante a dentinogénese primária, a secreção da dentina secundária fisiológica continua a uma taxa muito mais lenta (cerca de 0,4 µm/dia) durante a vida biológica do dente (Smith et al., 2012).
A formação de dentina secundária fisiológica leva a uma lenta redução no tamanho da câmara de polpa, à medida que a matriz é depositada circumpulparmente (Bleicher, 2014). Esta redução da taxa de dentinogénese deve-se a uma diminuição da atividade odontoblástica que se reflete, também, na aparência das células (Pashley, 1996). Vários estudos morfológicos indicam alterações na célula odontoblástica, que incluem o encurtamento do corpo celular e a diminuição no número de organelas responsáveis pela síntese e pela secreção da célula. No entanto, os odontoblastos pós-mitóticos originais, responsáveis pela dentinogénese primária, sobrevivem durante a vida do dente, a menos que sejam sujeitos a traumas. Essencialmente, a célula entra em estado de repouso após a dentinogénese primária e a formação limitada de dentina secundária ao longo de várias décadas, representa o nível basal de atividade destes odontoblastos em estado quiescente (Bleicher, 2014; Franquin et al., 1998; Simon et al., 2009). Estudos recentes referem que os odontoblastos de dentes permanentes desenvolvem um sistema autofágico-lisossomal, com funções de turnover e de degradação de componentes celulares, sendo responsável pela organização do normal funcionamento destas células durante
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décadas. A redução desta atividade autofágica, em dentes envelhecidos, está associada a uma progressiva acumulação de grânulos de lipofuscina e podem comprometer a sobrevivência dos odontoblastos (Franquin et al., 1998; Smith et al., 2012). Para alguns autores, a formação completa da raiz é o ponto em que termina a formação de dentina primária (Bleicher, 2014; Goldberg et al., 2011) e se inicia a formação de dentina secundária, enquanto que para outros esta transição ocorre quando se inicia a erupção do dente (Smith et al., 2012; Tziafas, 1994; Tziafas, Smith e Lesot, 2000). Até agora, o ponto absoluto em que a atividade dos odontoblastos se modifica, refletindo a transição da secreção de dentina primária para secundária, está indefinido. Sem alterações fenotípicas é difícil delimitar, no espaço e no tempo, os dois tipos de dentinogénese, que até poderão ocorrer concomitantemente no mesmo dente, dependendo do estádio de desenvolvimento (Simon et al., 2009).
Dentinogénese terciária ou reparativa
Dependendo da resiliência do órgão pulpar e da severidade da lesão, a polpa dentária pode entrar num processo de necrose ou num processo de resposta defensiva. Esta reação defensiva a estímulos nocivos pode ter vários mecanismos, nomeadamente através da precipitação de calcificações intrapulpares, da deposição de dentina peritubular com formação de dentina terciária, ou da redução da permeabilidade da dentina pré-existente (Sangwan et al., 2013). A forma mais frequente do complexo dentino-pulpar responder a traumatismo ou a lesão (cárie, atrição, erosão, materiais de restauração dentária, entre outras) é através da formação de uma barreira de tecido mineralizado. Esta resposta caracteriza-se pela deposição focal, sob a lesão, de uma matriz dentinária terciária, que tem como objetivo fundamental criar uma barreira entre o local da lesão e as células pulpares. A matriz dentinária terciária pode ter estrutura tubular variável o que, de certo, influenciará a permeabilidade dentinária nesta região. Estas propriedades da barreira da matriz de dentina terciária são fundamentais tanto para a proteção da vitalidade pulpar como para a obtenção de uma base mais sólida de tecido duro que é importante para subsequente restauração do tecido lesado. Podemos, assim, dizer que a
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61 natureza das respostas dentinogénicas terciárias pode ser importante na determinação das propriedades da nova matriz (Murray et al., 2003; Tziafas, 1994, 1995).
A dentinogénese reacional resulta das atividades dos odontoblastos pós-mitóticos, responsáveis pela formação da dentina primária, pelo que pode ser considerada como uma extensão da dentinogénese fisiológica. No entanto, é uma resposta patológica a uma lesão e, como tal, deve ser considerada distinta das dentinogéneses primária e secundária. Representa uma regulação positiva das atividades de síntese e de secreção dos odontoblastos a partir de um estado relativamente latente durante a dentinogénese fisiológica (Couve, Osorio e Schmachtenberg, 2014; Sangwan et al., 2013; Smith et al., 1995). A possibilidade de regeneração do tecido pulpar é restrita devido, não só à disposição anatómica da câmara pulpar, como ao reduzido suprimento sanguíneo colateral da polpa dentária que prejudica a capacidade do sistema imunológico de combater as infeções (Cooper et al., 2010; Couve, Osorio e Schmachtenberg, 2014). Além disso, os odontoblastos são células pós-mitóticas que têm capacidade de proliferação nula ou muito limitada (Demarco et al., 2011). No caso de lesão ligeira do tecido dentário, os odontoblastos responsáveis pela secreção primária da dentina frequentemente sobrevivem e são estimulados a secretar uma matriz dentinária reacional, na interface polpa-dentina sob o local da lesão. Uma vez que os odontoblastos primários originais são responsáveis por esta secreção matricial, haverá continuidade tubular e comunicação com a matriz dentinária primária, formando-se um tecido designado de ortodentina (Pashley, 1996; Smith et al., 2012, 2012).
Em contraste com a resposta formadora de dentina reacional, a dentinogénese reparadora representa uma sequência mais complexa de processos biológicos como se observa na Figura 3. Antes da regulação positiva da secreção da matriz, a migração e a diferenciação das células progenitoras pulpares, as stem cells, deve ocorrer para dar origem a uma nova geração de células tipo odontoblastos (Linde e Goldberg, 1993; Simon et al., 2009; Tziafas, 1994). Concomitantemente, ocorre uma série de reações de cicatrização no tecido conjuntivo pulpar, acompanhada de uma reação inflamatória generalizada.
Quando as lesões são mais graves, os odontoblastos imediatamente abaixo da lesão podem morrer. Tanto o trauma como a infeção bacteriana podem levar à libertação de neuropeptídeos
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e ao aumento da permeabilidade capilar, donde resulta a produção de transudato que se acumula entre a camada de odontoblastos e a pré-dentina o que, por sua vez, pode levar à rutura dos complexos juncionais inter-odontoblásticos (Embery et al., 2001). A libertação de mediadores inflamatórios e de citocinas pode contribuir para o processo de cicatrização do tecido pulpar ou para reações inflamatórias mais generalizadas através do aumento da permeabilidade vascular e da pressão tecidual no ambiente pulpo-dentinário (Cooper et al., 2010; Murray et al., 2003). Estes fatores de crescimento podem ser libertados devido ao ambiente acídico provocado pela lesão de cárie. Se as condições adequadas prevalecerem dentro do tecido pulpar, as células progenitoras são estimuladas a diferenciar-se numa nova geração de células semelhantes a odontoblastos e a secretar uma matriz reparadora da dentina (designada de osteodentina) (About, 2011; Cooper et al., 2010; Ranly et al., 1997). Esta nova matriz implica descontinuidade na estrutura tubular, com subsequente redução da permeabilidade dentinária. Podem ser observadas respostas não-específicas que levam à deposição de fibrodinina ou matriz osteotípica atubular, mas não representam uma indução verdadeira de dentinogénese reparadora (Bleicher, 2014). A morte de alguns odontoblastos e a sobrevivência de outros pode levar à formação de uma matriz dentária terciária reacional menos organizada e mineralizada, com menor densidade tubular e com apenas parte das propriedades de permeabilidade da dentina primária (Demarco et al., 2011). Esta modificação da permeabilidade é fundamental pois condiciona alteração da difusão que, em conjunto com a da capilaridade, pode permitir que substâncias tóxicas atinjam a polpa, através da matriz dentinária e dos túbulos dentinários, que podem atuar como irritantes se a concentração atingir um limiar inflamatório (Cooper et al., 2010; Smith et al., 2012, 2012). A concentração de substâncias que se difundem através da dentina para o tecido pulpar depende, em parte, da taxa de remoção das toxinas através da circulação pulpar e do coeficiente de filtração da dentina (Tziafas, Smith e Lesot, 2000). Tendo em conta a composição e o arranjo morfológico, a permeabilidade da matriz de dentina, secretada após a lesão, pode ser muito importante no comportamento clínico dos tecidos.
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Figura 3: Esquema ilustrativo dos diferentes processos biológicos que ocorrem na dentinogénese reparadora. O limite externo do tecido pulpar, isto é, a transição com o tecido duro dentinário, é formado por uma monocamada de células com forma tubular e com diversas ligações celulares, a camada odontoblástica (1). O interior da polpa dentária (2) é composto por um tecido de sustentação complexo com diversos tipos de células e um plexo vasculo-nervoso. Quando ocorre um traumatismo no tecido pulpar, com perda da integridade da camada externa, é desencadeada uma cascata de processos no sentido da reparação desta lesão, designada por dentinogénese reparativa ou reparadora. Células indiferenciadas (stem cells) (a) presentes no interior do tecido pulpar são estimuladas por diversos fatores, ocorrendo migração (b) e diferenciação (c) até células tipo-odontoblasto. As células tipo-odontoblasto diferenciadas substituem os odontoblastos lesados na zona onde ocorreu o traumatismo (d). Simultaneamente, ocorrem reações de cicatrização no tecido conjuntivo pulpar através dos fibroblastos pulpares (3), de diversas células nervosas (4) e de alterações vasculares arteriais e venosas (5). Adaptado de (Tziafas, Smith e Lesot, 2000) e de Servier.com (This work is licensed under the Creative Commons Attribution 3.0 Unported License. To view a copy of this license, visit http://creativecomons.org/licenses/by/3.0/).
Tem sido sugerido que, em termos clínicos, um dos objetivos principais de uma proteção pulpar direta deve ser a redução da permeabilidade dentinária como ocorre na dentina em resposta à lesão. Embora a manutenção da arquitetura normal dos tecidos tubulares possa ser considerada uma característica importante de qualquer estratégia de reparação tecidual, isto não se justifica quando existe o risco de lesões teciduais resultantes da difusão tubular de agentes nocivos. Foram descritos três padrões de reação da dentina que se traduzem na redução da permeabilidade. Estes padrões são a aposição de dentina peritubular, a precipitação de cristais intratubulares e a formação de dentina reativa menos permeável. O objetivo de qualquer
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estratégia terapêutica deverá ter em conta estes padrões (Bleicher, 2014; Demarco et al., 2011; Ranly et al., 1997).
O processo da dentinogénese nas suas diversas vertentes, quer fisiológicas, quer patológicas foi descrito atrás numa perspectiva macroscópica, isto é, baseado na composição e nas propriedades estruturais do tecido dentinário. No entanto, este tecido é uma matriz bioativa, onde moléculas bioativas interagem nas diversas etapas da formação e reparação do tecido dentinário. Assim, é fundamental compreender as suas potenciais ações nas células do complexo dentino-pulpar, para que o seu potencial seja explorado clinicamente. Entre estas biomoléculas, existem as proteínas específicas da dentina produzidas pelos os odontoblastos, como a DSP e a DPP. Estas são codificadas por um único gene conhecido como DSPP (do inglês,
dentin sialophosphoprotein gene). A expressão deste gene está associada à dentinogénese e ocorre após a formação de uma matriz colagénica de pré-dentina. A DSP e a DPP são produzidas abundantemente pelos odontoblastos e em níveis muito baixos noutros tecidos, tais como o osso e o rim. A DMP-1, outra proteína específica da dentina, foi descrita como reguladora da sua mineralização, semelhante à DSP e à DPP (Butler, 1995). O gene codificador da DMP-1 também desempenha um papel regulador na organização da matriz colagénica e pode funcionar como um sinalizador. Portanto, a regulação positiva de DSP e DMP-1 é considerada indicativa de