Objetivos e Guião Entrevista Semiestruturada GP

major et la déficience en VSG lipase chez un mutant sanguicole de T. brucei

sont corrélés avec un phénotype de croissance cellulaire atténuée

Plus récemment, l'étude faite sur des formes promastigotes de Leishmania major

(forme infectieuse de l'homme) forcées par transfection à exprimer la GPI-PLC de T. brucei

suggère que la biosynthèse des précurseurs de GPI est initiée sur la face cytoplasmique du

réticulum endoplasmique (Mensa-Wilmot et al, 1994). Cette disposition topographique

particulière de l'enzyme PLC, lors de la biosynthèse des précurseurs des molécules

Introduction

liées (gp63), a permis de comprendre le phénotype GPI-négatif observé chez le mutant. En

effet, l'observation que le mutant sécrète la protéine gp63 qui normalement est ancrée dans la

membrane via son radical GPI et que celle-ci est GPI-négative car elle n'a pas reçu le l'ancre

GPI suggère que, chez Leishmania, l'activité non contrôlée de l'enzyme exogène est suffisante

pour cliver les intermédiaires de précurseurs de GPI accumulés au cours de leur biosynthèse

(hypothèse de déplétion en précurseurs GPI). Par conséquent, les protéines avec leur séquen­

ce hydrophobe C-terminale, signal d'addition du glycolipide, ne reçoivent pas l'ancre GPI

pendant leur transit à travers la membrane du RE et finissent par être sécrétées dans la poche

flagellaire via l'appareil de Golgi. S'il en est ainsi chez Leishmania, pourquoi le VSG des

trypanosomes africains ne serait-il pas sécrété comme la gp63 de Leishmania! Il semblerait

que chez la forme sanguicole de T. brucei, la VSG lipase soit modifiée ou plus exactement

palmitylée au niveau de trois résidus cystéine (F. Paturiaux-Hanocq & J. Hanocq-Quertier,

communication personnelle). On a spéculé que chez le trypanosome cette modification

permettrait le maintien de l'activité de l'enzyme dans un état quiescent, ce qui empêcherait la

dégradation des molécules précurseurs de GPI dans les conditions physiologiques normales

(Mensa-Wilmot et al., 1994). Un signal extracellulaire (par exemple: la lyse hypotonique)

pourrait déclencher la démodification de l'enzyme lui permettant de devenir enzymatiquement

active. Une autre possibilité serait que l'acylation contrôle la localisation de l'enzyme et donc

son accès au substrat, ce qui aurait aussi comme conséquence une levée de l'(in)activation de

l'enzyme.

En plus de leur phénotype GPI-négatif, les cellules promastigotes de Leishmania

exprimant la GPI-PLC de T. brucei montrent une croissance in vitro ralentie par rapport à des

cellules contrôles transformées par le même vecteur, comportant seulement le gène de

résistance à l'antibiotique. Suivant la concentration en antibiotique employée au cours de la

sélection, le taux de croissance des cellules GPI-négatives peut être réduit de moitié et à de

plus fortes doses, on arrive même à obtenir un taux de croissance nul par rapport aux cellules

contrôles (Mensa-Wilmot, 1994). Cette croissance atténuée pourrait être due à la déficience en

ectoprotéines (GPI-liées) servant de récepteurs à des facteurs de croissance (Mensa-Wilmot et

al, 1994). Il est tentant de spéculer qu'une protéine fixatrice de transferrine similaire à celle de

T. brucei (TfBP) pourrait être un candidat potentiel responsable du phénotype de croissance

ralentie chez Leishmania. A cet égard, les auteurs remarquent que outre la protéine gp63

majoritairement sécrétée dans le milieu de culture, 3 autres protéines peuvent y être détectées

et sont des candidats potentiels pour la ou les molécule(s) déficiente(s).

Encore plus récemment, un mutant sanguicole de T. brucei nul pour la GPI-PLC a été

obtenu par destruction des deux allèles du gène de VSG lipase par recombinaison homologue

ciblée dans des formes procycliques, suivi d'une transmission cyclique dans la glossine pour

générer les mutants sanguicoles. Les observations suivantes ont été effectuées sur ce mutant

Introduction

(Webb, 1994; Roline/ût/., 1996):

(i) In vivo, dans des souris infectées par le mutant sanguicole, on observe que la

parasitémie fluctue pendant les 30 premiers jours de post-infection (Webb, 1994). Le fait que

la densité de parasites fluctue au cours du temps, et que l'infection persiste chez la souris

pendant une longue période de temps, indique que la variation antigénique n'est pas abolie

dans des souris infectées par le mutant nul (voir la figure 15). Ces résultats suggèrent que la

VSG lipase n'est pas essentielle au processus de variation antigénique. En outre, les

paramètres de différenciation de la forme sanguicole en forme procyclique sont les mêmes dans

les populations mutantes et contrôles, ce qui confirme les résultats antérieurs suggérant plutôt

l'intervention d'une protéase dans l'élimination du VSG au cours de la différenciation

(Ziegelbauer et al, 1993; Rolin et al, 1996). Ces observations suggèrent que la GPI-PLC n'est

essentielle à aucun stade du cycle de vie du parasite. Néanmoins, en regardant de plus près, on

constate que l'intensité des pics de parasitémie fléchit au cours du temps et que, après les deux

premiers pics, les vagues de parasitémie suivantes deviennent difficiles à discerner (autour de 3

X lO^parasites ml‘l) (données non montrées). Cette observation pourrait résulter du fait que la

population mutante devient de plus en plus hétérogène en terme de variant antigénique

exprimé. Il pourrait en résulter que, après plusieurs semaines d'infection, la fluctuation au

niveau de la population globale résulte d'une intégration de pics discrets qu'on ne peut séparer

individuellement. A cet égard, il faut savoir que la population cellulaire de départ, c'est-à-dire

venant de la toute première infection in vivo, n'est pas une population clonale. En effet, des

expériences d'immunofluorescence faites par technique de "Flow cytometry" sur une

population de cellules déficientes en GPI-PLC indiquent qu'un mélange de variants paraissent

coexister au sein de la même population cellulaire (S. Rolin, communication personelle). La

même observation a été faite pour la population contrôle, excepté que dans ce cas, on observe

que la population semble moins hétérogène en terme de variant antigénique exprimé.

Cependant, par des expériences d'immunofluorescence en microscopie optique faites sur des

cellules mutantes fixées, on a pas encore pu mettre en évidence la coexistence de plusieurs

variants antigéniques différents sur une même cellule. Même s'il a été démontré que pendant la

période de remplacement du manteau, la cellule sanguicole passe par un stade transitoire où

elle exprime deux variants en même temps, il paraît peu vraisemblable que cet état de double-

expresseur puisse se poursuivre pendant un temps trop long, au risque d'être neutralisé par le

système immune de l'hôte (Esser & Schoenbechler, 1985). Néanmoins, à l'heure actuelle, nous

ne pouvons exclure que le mutant accumule à sa surface plusieurs variants antigéniques. Quoi

qu'il en soit, la variation antigénique que l'on observe chez des souris infectées par le mutant

démontre que celui-ci doit avoir conservé un mécanisme qui lui permette de larguer son

manteau antigénique de surface.

Figure 15

Fluctuations de la parasitémie au cours du temps chez des souris de laboratoire infectées

avec le contrôle (CAT-hyg^^) (A) ou le mutant nul déficient en GPI-PLC (B).

Chaque courbe représente une souris injectée par voie intrapéritonéale a\^ec 2x10-

cellules. Le point zéro de l'axe Y représente la parasitémie en dessous du niveau limite

de détection expérimentale (<1x10^ parasites/ml). D'après Webb, 1994.

Introduction

(ii) L'analyse d'immunodétection par technique de Western blot montre que le VSG

présent dans des extraits de trypanosomes déficients en lipase, quoique CRD-négatif, a une

taille similaire à la forme membranaire du VSG des contrôles. Ce n'est qu'après un traitement

par une PI-PLC bactérienne que le VSG du mutant devient CRD-positif et adopte une taille

comparable à celle du sVSG du contrôle. Ces données confirment que, en absence du gène de la

GPI-PLC, il n'y a plus d'interconversion mfVSG => sVSG lors d'un choc hypotonique, comme

cela se passe chez le contrôle. L'ensemble de ces observations suggère que si la VSG lipase est

déficiente chez les mutants, il existe un autre mécanisme, vraisemblablement constitutif,

permettant la libération continue de molécules de VSG nécessaire au remplacement rapide du

manteau pendant la variation antigénique. Cependant, même si la GPI-PLC ne semble pas

nécessaire au processus de variation antigénique nous ne pouvons exclure que, in vivo, chez

l'hôte naturel, celle-ci soit nécessaire afin d'accroître le taux de remplacement du manteau à

certains moments du processus. Des conditions de stress pourraient être le signal déclencheur

de l'activation de la VSG lipase, permettant au parasite une réponse adaptative au stress

(Rolin et û/., 1996).

(iii) Au cours de la variation antigénique (voir la figure 15), les pics de parasitémie ont

une taille réduite par rapport à ceux des trypanosomes contrôles. Cette observation suggère

une croissance atténuée chez le mutant sanguicole déficient en VSG lipase. S'il est tentant de

spéculer l'intervention de récepteurs GPI-liés de facteurs de croissance (déficience dans

l'internalisation de facteurs de croissance ou de nutriments), il existe plusieurs autres raisons

pour expliquer la croissance atténuée du mutant nul:

(a) déficience dans la biosynthèse des précurseurs de GPL Si nous savons que le clivage de

mfVSG du mutant nul est possible et génère un VSG portant le néo-épitope CRD caracté­

ristique de tous les molécules GPI clivées, nous ne savons pas si la cinétique de la biosynthèse

des précurseurs GPI est altérée. A cet égard, il faut rappeler que l'enzyme se trouve proba­

blement dans la même localisation topographique que les précurseurs GPI (Mensa-Wilmot,

1994);

(b) une seconde possibilité serait d'imaginer que l'atténuation ne résulte pas d'une diminution

de la croissance, mais plutôt d'une différenciation prématurée des cellules sanguicoles en for­

mes "stumpies" ne se divisant plus. D'après H. Webb, les observations morphologiques ne

sont cependant pas en accord avec cette hypothèse (Webb, 1994).

Dans la troisième partie des résultats de la thèse, nous étudierons plus particulièrement

le rôle possible joué par le récepteur de transferrine dans le phénotype de croissance atténuée

du mutant sanguicole de T. brucei déficient en VSG lipase.

But

BUT

La forme sanguicole du trypanosome africain, Trypanosoma brucei, protozoaire

unicellulaire, se multiplie activement dans le sang de l'hôte tout en échappant à la réponse

immunitaire de l'hôte par changement périodique de son revêtement antigénique de surface

(VSG). Comme d'autres parasites, T. brucei requiert une internalisation rapide et efficace de

macromolécules sériques qu'il puise dans le sang de son hôte mammifère. Par conséquent, au

cours de la variation antigénique, le trypanosome doit relever un défi de taille indispensable à

sa survie: assurer l'endocytose de facteurs de croissance via des récepteurs spécifiques tout en

évitant la réaction immune de l'hôte contre les épitopes invariants nécessaires à la recon­

naissance spécifique des ligands. Dans ce travail de thèse, nous avons étudié ce problème plus

particulièrement au niveau du mécanisme d'internalisation d'un facteur de croissance: la

transferrine sérique. Des études préalables suggéraient que l'endocytose de transferrine se

produit par l'intermédiaire de récepteurs spécifiques et saturables localisés dans la poche

flagellaire du parasite, une invagination de la membrane plasmique à la base du flagelle

(Coppens et al, 1987; 1988; Webster & Grab, 1988). Cependant, on ne savait pratiquement

rien quant à la nature du récepteur de transferrine. Ce choix de participer à la caractérisation

d'un récepteur ne tient pas au hasard, mais plutôt à une volonté de continuité dans la poursuite

de l'étude que nous avions entreprise afin de caractériser le site d'expression télomérique du

gène d'antigène de surface du variant AnTat 1.3A de T. brucei (voir l'article de l'annexe 1; Pays

et al, 1989b). Lors de cette étude, nous avions caractérisé un ensemble de gènes co-transcrits

avec le gène de VSG, durant la phase sanguicole, et donc appelés "gènes associés au site

d'expression" (ESAGs). Ce site d'expression fut utilisé par d'autres équipes comme modèle

pour l'étude de sites d'expression télomériques appartenant à d'autres variants. L'ensemble de

ces études révéla que tous les sites d'expression avaient en commun la conservation de la

succession de ces gènes ESAGs sur une longueur de 45 à 60 kb, depuis le promoteur jusqu'au

VSG. Mis à part ES AG 4 qui code pour une adénylate cyclase (Ross et al, 1991; Paindavoine

et al, 1992; Pays et al, 1989b), la fonction de ces gènes était inconnue. Lors de l'étude du site

d'expression du variant AnTat 1.3A, j'avais participé plus particulièrement à la caractérisation

des deux gènes ESAG 6 et 7, les premiers gènes de l'unité de transeription polycistronique,

situés immédiatement en aval du promoteur de transcription. Ces gènes fortement homologues

semblaient coder pour des protéines à destination membranaire, exprimées uniquement dans la

forme sanguicole du parasite et, mise à part leur faible homologie de séquenee avec un variant

de VSG métacyclique, ne présentaient aucune homologie de séquenee avec des séquences

But

connues. Ainsi, si nous pensions que ces gènes pouvaient être importants à la survie du

parasite pendant sa phase sanguicole, nous n'avions aucune idée quant à leur(s) fonction(s). Ce

n'est que plus tard, suite à la purification par Shell et col. (1991b) d'une protéine de 42 kDa

fixatrice de transferrine (TIBP) dont le microséquençage partiel révéla une identité de séquence

avec les produits présomptifs des gènes ESAG 6 et 7, qu'un rôle put être suggéré pour les

protéines codées par ces gènes. Etant donné la forte similitude des protéines codées par ESAG

6 et 7 (86%), il n'était pas clair si la TfBP était composée des produits des gènes ESAG 6 ou

ESAG 7 ou des deux à la fois. Par ailleurs, si la protéine pESAG 6 est très homologue à

pESAG 7, elle diffère de cette dernière par la présence d'une queue hydrophobe C-terminale

suggérant que pESAG 6 pouvait être accrochée à la membrane de manière covalente par un

radical d'ancrage glycosylphosphatidylinositol (GPI). Plus récemment, il fut démontré que la

TfBP de 42 kDa ne possédait pas le radical d'ancrage GPl, ce qui suggérait que cette protéine

était codée plus probablement par ESAG 7 que par ESAG 6 (Shell et al, 1993). Comme

pESAG 7 possède la même séquence signal N-terminale que pESAG 6, il paraissait illogique

pour le parasite de synthétiser une protéine fixatrice de transferrine tronquée et destinée à

l'export.

Pour déterminer sans ambiguïté le rôle des protéines pESAG 6 et 7 dans la fixation et

l'internalisation de la transferrine, nous avons entrepris la reconstitution in vitro des complexes

fixant la transferrine par expression transitoire des protéines pESAG 6/7 par des oocytes de

Xenopus laevis qui normalement ne fixent pas la transferrine.

Par ailleurs, suite à la découverte récente d'homologies importantes de séquences

partagées entre un VSG et les protéines pESAG 6/7, nous avons entrepris un début d'étude

sur les caractéristiques structurales conservées entre les molécules de VSG et le récepteur de

transferrine et ses implications dans la détermination du site présomptif de fixation du ligand

par le récepteur.

Afin d'élucider la raison pour laquelle une fraction importante des récepteurs de

transferrine se trouve libre dans la lumière de la poche flagellaire, un troisième volet de cette

thèse a été consacré à l'étude du mode de largage du récepteur dans la poche flagellaire du

parasite qui, de la même manière que le VSG, par son mode d'ancrage GPl-lié à la membrane,

est sensible à la phospholipase C bactérienne et peut donc être un substrat potentiel de la

VSG lipase endogène du trypanosome sanguicole.

Matériel et méthodes

MATERIEL ET METHODES

No documento As percepções e práticas dos docentes sobre as metas de aprendizagem numa escola básica integrada - a supervisão como estratégia de inovação pedagógica (páginas 167-174)