Objetivos específicos

1. Triar os pacientes com DI para a síndrome do X frágil.

2. Nos que não apresentarem alterações no item 1, identificar através de arrays genômicos os pacientes portadores de ganhos e perdas de segmentos de DNA.

3. Sequenciar os exomas dos pacientes que não apresentarem alterações nos itens 1 e 2, bem como os de seus genitores.

4. Analisar os exomas dos pacientes em busca de variantes que expliquem o quadro clínico, testando as hipóteses de herança autossômica dominante (de novo), herança autossômica recessiva (em homozigose ou heterozigose composta) e ligada ao X recessiva (presente na mãe e no filho afetado).

5. Realizar aconselhamento genético das famílias dos pacientes investigados

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Capítulo III: Casuística

63 III.1. Pacientes

Os pacientes foram encaminhados do Serviço de Aconselhamento Genético do IB-USP. Agradecemos à Drª Angela M. Vianna-Morgante, Drª. Ana Krepischi, Dr. Paulo Otto, Drª Débora Bertola, Dr. Fernando Kok, Dr. Eduardo Fusão, Drª Tânia Vertemati, Drª Liane Giuliani, Dr. Marcial Galera, Dr. Juan Llerena Jr., Drª Fabíola Monteiro, Dr. Eduardo Perrone; pela avaliação clínica e encaminhamento dos pacientes.

Foram excluídos do estudo aqueles pacientes do sexo masculino que tiveram resultado positivo para a síndrome do X-frágil; também foram excluídos da casuística aqueles pacientes de ambos os sexos que revelaram desequilíbrios genômicos no teste de array-CGH realizado na plataforma 180K da Agilent Technologies (Santa Clara, Califórnia, EUA) ou no teste de SNP array na plataforma 850K da Illumina (San Diego, Califórnia, EUA).

Todos os pacientes encaminhados para a pesquisa possuem em comum DI limitante (moderada-grave), embora a maioria não tenha sido avaliada por testes de QI. Alguns pacientes apresentavam sinais adicionais, tais como: ataxia, problemas cardiovasculares, catarata, entre outros (a Tabela 7 sumariza os achados clínicos nos pacientes incluidos na amostra). Os responsáveis pelos pacientes assinaram o termo de consentimento livre esclarecido (Anexo 1) concordando com a participação na pesquisa. Foram coletadas amostras de sangue periférico (5-10ml) em tubos com EDTA como anticoagulante dos pacientes e de seus genitores.

Tabela 7: Sinais clínicos presentes nos pacientes participantes da pesquisa

Pacientes Sexo Idade Sinais clínicos*

Ocorrências durante a gestação PCGH948 M 5 anos Atraso no desenvolvimento neuropsicomotor, cardiopatia congênita, dismorfias faciais.

Restrição de crescimento intrauterino, nascimento prematuro.

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PCGH856 F 11 anos

Atraso no desenvolvimento neuropsicomotor, ausência de linguagem/fala, crises convulsivas, catarata congênita bilateral, hipotonia

de membros superiores e inferiores

-

PCGH319 F 6 anos

Atraso no desenvolvimento neuropsicomotor, hipotonia, palato em ogiva, dismorfias faciais, malformação

renal e cardíaca.

-

PCGH584 M 11 anos

Atraso no desenvolvimento neuropsicomotor, ausência de

linguagem/fala, não anda, encefalopatia crônica não evolutiva,

ressonância magnética de crânio normal.

-

PCGH1031 F 5 anos

Atraso no desenvolvimento neuropsicomotor, microcefalia, ptose

palpebral, sinofris, prega única de flexão em mão esquerda e parcial em

mão direita. Mecônio na cavidade amniótica PCGH1005 F 23 anos Atraso no desenvolvimento neuropsicomotor, ausência de linguagem/fala, dismorfias faciais,

deficiência auditiva bilateral, apêndices pré-auriculares bilaterais,

doença renal multicística, cisto aracnoide.

-

PCGH289 M 17 anos Malformações múltiplas, encurtamento

proximal dos membros -

PCGH1454 F 6 anos

Atraso no desenvolvimento neuropsicomotor, dismorfias faciais

(hipertelorismo, telecanto, epicanto inverso, ponte nasal alargada), atraso no desenvolvimento motor, fala pouco

desenvolvida.

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Capítulo IV: Metodologia

66 IV.1. Construção de bibliotecas e sequenciamento dos exomas

As bibliotecas foram construídas usando o kit SureSelect XT ou SureSelect QXT da Agilent Technologies® e o procedimento usado é o descrito pelos fabricantes, como relatado a seguir. Para a construção da biblioteca de exons usamos amostras de DNA extraídas com protocolo fenol:clorofórmio, diluídas na concentração de 200ng de DNA em um volume de 50μl; as concentrações das amostras são mensuradas usando o Qubit (Qubit® 2.0 Fluorometer), e os kits Qubit® dsDNA BR Assay Kit, 100 assays e Qubit® dsDNA HS Assay Kit, 100 assays da Invitrogen® (Thermo Fisher Scientific™). As amostras construídas com o uso do kit SureSelect XT Target Enrichment System for Illumina Paired-End foram submetidas a uma fragmentação mecânica (6 ciclos de 60 segundos) no equipamento Covaris® S2 (Thermo Fisher Scientific). Nesse projeto, utilizamos o equipamento Covaris disponível no CEFAP (Centro de Facilidades para a Pesquisa), centro multiusuário, localizado no prédio do Instituto de Ciências Biomédicas II da Universidade de São Paulo (USP), campus São Paulo. As amostras que tiveram a biblioteca construída usando o kit QXT passaram por uma fragmentação enzimática, ao invés de mecânica, de acordo com o protocolo.

Para verificar se a fragmentação resultou nos tamanhos de DNA esperados (entre 150 pb a 200 pb) foi usado o equipamento Bioanalyzer 2100 com o kit High Sensitivity DNA assay, também comercializados pela Agilent technologies®. Deve-se obter um gráfico de distribuição dos tamanhos dos fragmentos semelhante ao das figuras abaixo. A Figura 2 foi retirada do protocolo e a Figura 3, de padrão semelhante, foi obtida no procedimento realizado em nosso laboratório:

67 Figura 2: Análise do DNA fragmentado usando o Bioanalyzer. O

eletroferograma mostra a distribuição almejada com um pico entre 120 e 150 pb.

Figura 3: Primeira avaliação da amostra pelo Bioanalyzer realizada em DNA de um paciente da coorte, mostrando o pico entre 120 e 150 pb, como exigido pelo

protocolo.

Os fragmentos foram então reparados por exonuclease, seguida de fosforilação das extremidades 5’ e adenilação da 3’, para facilitar a ligação dos adaptadores, que permitirão a ligação aos primers durante reação de PCR. Após a amplificação da biblioteca por PCR, é feita uma segunda verificação de qualidade usando o 2100 Bioanalyzer, dessa vez com o kit DNA 1000 assay; com a adição dos adaptadores, espera-se encontrar fragmentos maiores, da ordem de 225 pb a 275 pb, como nos gráficos abaixo. A Figura 4 foi retirada do

68 protocolo e a Figura 5, de padrão semelhante, foi obtida no procedimento realizado em nosso laboratório:

:

Figura 4: Análise do DNA fragmentado usando o Bioanalyzer. O

eletroferograma mostra a distribuição esperada, com pico entre 225 e 275 pb.

Figura 5: Segunda avaliação de amostra pelo Bioanalyzer, realizada em DNA de um paciente da coorte.

A partir desse eletroferograma, pode-se ajustar a concentração de 750ng de DNA em um volume máximo de 3,4 μl.A amostra é então hibridada à biblioteca de captura que consiste em RNAs biotinilados complementares à região de interesse, nesse caso os exons. O DNA capturado por sondas biotiniladas é recuperado por beads magnéticas com estreptavidina. A estes fragmentos alvo

69 recuperados para sequenciamento, são adicionados indexes que permitirão identificar a amostra após o sequenciamento.

Outra verificação de qualidade é feita usando o 2100 Bioanalyzer e o kit High Sensitivity DNA assay. Nessa etapa é esperado que os fragmentos estejam entre 250 pb a 350 pb, como nas figuras abaixo. A Figura 6 foi retirada do protocolo e a Figura 7, de padrão semelhante, foi obtida no procedimento realizado em nosso laboratório:

Figura 6: Análise do DNA fragmentado usando o Bioanalyzer. O eletroferograma mostra uma distribuição com pico entre 250 e 350 pb.

Figura 7: terceira avaliação de amostra pelo Bioanalyzer realizada em DNA de um paciente da coorte.

70 Além da avaliação das amostras pelo Bioanalyzer, também é utilizada uma PCR quantitativa usando o sistema MX3005P e o SYBR Green para determinar a concentração de cada biblioteca já com os indexes e ajustar a concentração para produzir um pool de ~10nM de cada biblioteca. O sequenciamento é realizado usando o sequenciador Hiseq 2500 da Illumina pelo Centro de Estudos do Genoma Humano (CEPID/FAPESP), do qual a orientadora faz parte. No sequenciamento da Illumina, os fragmentos com adaptadores se ligam através de uma das extremidades a pequenos oligonucleotídeos que estão fixos em uma lâmina. No primeiro ciclo de amplificação da PCR em fase sólida, o adaptador da extremidade livre da molécula aderida encontra seu oligonucleotídeo complementar no suporte, formando uma estrutura em ponte. Após 35 ciclos de PCR, são adicionados nucleotídeos diferencialmente marcados com terminadores (impedem a associação de outros nucleotídeos) aos clusters. Quando pareado com sequência complementar, a luz do laser excita o fluorocromo e a imagem é gravada; em seguida o terminador e a fluorescência são retirados para permitir que outro nucleotídeo marcado seja adicionado, e assim por diante até obtermos as sequências de todos os fragmentos. O sequenciador Hiseq 2500 da Illumina possui um maior output quando comparado com o Miseq da mesma empresa, chegando a ser 100 vezes maior (1500 Gb); o Hiseq pode gerar até 5 bilhões de reads por corrida, o Miseq 25 milhões; o tempo de corrida varia de 7 horas até 6 dias.

Uma revisão do processo de sequenciamento pode ser encontrada em Shendure e Ji (2008)

71 Figura 8: Fluxograma da metodologia utilizada nesse projeto