Obtenção das formulações e avaliação da estabilidade

As nanoemulsões 1 e 2 (NE1 e NE2) e os hidrogéis 1 e 2 (H1 e H2), foram preparados fazendo-se uso de 5% de tensoativos, na proporção de 96,37% de polissorbato 20 e 3,63% de monooleato de sorbitano, a fim de obter EHL 16,5, previamente determinado experimentalmente por Fernandes et al., 2013. Utilizou-se dois métodos de emulsificação para obtê-las: emulsificação espontânea com aquecimento e titulação à frio. As amostras foram armazenadas à 25°C durante 60 dias. A Figura 21 apresenta imagem das nanoemulsões e dos hidrogéis, logo após a preparação.

Figura 21: Formulações desenvolvidas: 1) nanoemulsão 1, produzida em processo sem aquecimento; 2) nanoemulsão 2, produzida em processo com aquecimento; 3) hidrogel 1, proveniente da nanoemulsão 1 com adição do agente espessante; 4)hidrogel 2, proveniente da

nanoemulsão 2 com adição do agente espessante.

Segundo a Farmacopéia Americana, a estabilidade é definida como “capacidade de um produto manter-se dentro dos limites especificados e apresentar as mesmas propriedades e características que possuía no momento da sua preparação, durante o período de armazenagem e uso” (USP, 2016).

A avaliação da estabilidade das formulações foi realizada 1, 7, 30 e 60 dias após a manipulação e as amostras armazenadas em temperatura ambiente (25°C ± 2). As amostras foram analisadas quanto às características sensoriais, pH, teor, potencial Zeta e distribuição de tamanho de partícula. Os resultados obtidos sugerem a integridade do produto durante os 60 dias de estudo. Todas as amostras apresentaram uniformidade de cor, manutenção do reflexo azulado, aspecto homogêneo e odor característico de alecrim, durante o período avaliado.

Segundo Aulton (2005), o estrato córneo é consideravelmente resistente a alterações de pH, tolerando uma variação de 3 a 9. Ferreira (2008) afirma que valores de pH entre 5 e 7, para formulações tópicas, evitam possíveis irritações cutâneas. A Tabela 2 apresenta os valores de pH obtidos para as nanoemulsões e os hidrogéis, no tempo 1 dia e 60 dias. As nanoemulsões apresentaram pH dentro da faixa recomendada para formulações tópicas, já os hidrogéis apresentaram pH ligeiramente básico, devido a necessidade de alcalinizar o meio para formação da rede de polímero. Comparando as metodologias usadas, pode-se observar que o método de emulsificação não interfere no valor do pH da formulação, uma vez que, comparando NE 1 e NE2, e H1 e H2, não apresentaram diferença significativa durante o período

avaliado(ANOVA, p>0,05).

Tabela 2: Valores de pH das formulações, após 1 e 60 dias de armazenagem em frascos de vidro, em temperatura ambiente (25ºC ± 2).

Amostras pH 1° dia 60° dia NE 1 5,94±0,17 5,73±0,17 NE 2 5,77±0,11 5,57±0,41 H 1 7,52±0,09 7,46±0,11 H 2 7,76±0,51 7,36±0,43

O potencial Zeta é um outro método de avaliar a estabilidade de uma emulsão através da medição da diferença de potencial entre o meio dispersante e a camada estacionária do líquido ligada à partícula dispersa. Estudos mostram que emulsões com valores superiores a +30mV e inferiores a -30mV apresentam boa estabilidade durante a estocagem, uma vez que forças repulsivas tendem a evitar uma possível floculação (ROLAND et al., 2003). Esse potencial é influenciado pela natureza química do polímero, do tensoativo, do pH do meio e da concentração dos componentes da formulação, inclusive do princípio ativo (SCHAFFAZICK et al., 2003; SIQUEIRA, 2008; TEIXEIRA, 2009). Os valores de potencial Zeta obtidos para as nanoemulsões produzidas nesse trabalho foram menores, em módulo, do que os obtidos para os hidrogéis (Tabela 3). Porém, quando comparamos os valores de NE 1 e NE 2 e H1 e H2, percebe-se que o método de emulsificação não influencia no potencial Zeta das formulações, visto que não houve diferença significativa entre os resultados (ANOVA, p>0,05). Já o aumento de potencial dos hidrogéis, em relação às nanoemulsões, pode ser atribuído ao uso do agente polimérico, que se adsorve à superfície das partículas. As cargas geradas pela ionização do polímero podem contribuir para o aumento do potencial Zeta e, em conseqüência, da formação de um sistema mais estável (GOUVÊA e MURAD, 2001). Essa maior estabilidade no entanto, não pôde ser observada durante os 60 dias do estudo. Como citado anteriormente, todas as amostras apresentaram características macroscópicas e sensoriais semelhantes durante o período avaliado.

Tabela 3: Resultados de tamanho médio das gotículas (nm), índice de polidispersão (IP) e potencial Zeta (mV) das formulações, após 1 e 60 dias de armazenagem em frascos de vidro, em temperatura ambiente (25ºC ± 2).

Amostra

Tamanho médio das

gotículas (nm) IP Potencial Zeta (mV)

1° dia 60° dia 1° dia 60° dia 1° dia 60° dia

NE 1 _{115,90±6,6 146,3±3,8 0,189±0,09 0,236±0,07 -16.9±1,7 -13.2±2,1}

NE 2 _{139,56±4,2 155,2±4,3 0,143±0,05 0,150±0,06 -16.8±1,9 -14,0±0,6}

H 1 178,41±8,2 189,2±13,3 0,218±0,03 0,228±0,06 -43.8±1,6 - 41,4±1,8

H 2 _{244,6±18,4 261,6±14,6 0,392±0,08 0,395±0,12 -39.5±1,6 -43,4±3,9}

O tamanho de gotícula é um parâmetro que apresenta relação direta com a estabilidade, penetração celular e biodistribuição. Foram obtidos diâmetros médios de gotícula inferior a 160 nm para as nanoemulsões e 270 nm para os hidrogéis, validando sua adequabilidade para aplicação tópica. De acordo com a literatura, diâmetros inferiores a 600 nm são recomendáveis para formulações farmacêuticas e cosméticas administradas topicamente por favorecerem a permeação e aumentar a biodisponibilidade do ativo (BOUCHEMAL et al., 2004). Todas as formulações apresentaram aumento, estatisticamente significativo, no tamanho médio de gotícula após 60 dias de estocagem (ANOVA, p<0,05).

Com os resultados obtidos, foi possível verificar que a adição do agente espessante impactou significativamente (t-Student, p<0,05) no tamanho médio das gotículas dos hidrogéis comparado com o das nanoemulsões que os originaram. Esse resultado já era esperado, visto que a adição de um agente espessante polimérico na fase aquosa dispersante leva à formação de uma rede tipo gel, a qual interfere na análise por DLS. Dessa forma, não pode-se considerar que os resultados obtidos para os hidrogéis traduzam o real diâmetro hidrodinâmico médio das micelas presentes nessas formulações. Uma análise microscópica por técnicas mais sofisticadas se tornam necessárias para a comprovação e determinação do real tamanho das gotículas nessas formulações semissólidas.

Ao compararmos as diferentes metodologias empregadas nesse trabalho, observa-se que não houve diferença significativa entre os tamanhos médios de gotícula de NE1 e NE2 (ANOVA, p≥0,05). Tal resultado sugere que as metodologias de baixo aporte energético são capazes de levar à formação de sistemas semelhantes, o que é corroborado pela estabilidade observada em ambas as formulações.

Outro parâmetro importante no estudo de estabilidade é o índice de polidispersão, número adimensional que traduz a homogeneidade na distribuição do tamanho das partículas. Um perfil de distribuição monomodal (Figura 22) foi observado mesmo após 60 dias de estocagem em temperatura ambiente, tanto para as namoemulsões quanto para os hidrogéis, não havendo diferença estatística significativa (t-Student, p>0,05).

Figura 22: Distribuição de tamanho de gotículas das formulações por espalhamento

dinâmico da luz (DLS), após 60 dias de estocagem em frascos de vidro à 25ºC ± 2.

A capacidade das nanoemulsões em incorporar e proteger o OERo, contra a volatilização, foi avaliada usando como parâmetro o teor do padrão eucaliptol presente nas preparações. No entanto, a análise por CLAE-DAD somente foi possível de ser realizada com as nanoemulsões (Tabela 4). Para cálculo do teor teórico, fez-se a correlação de óleo utilizado (5%) e o percentual de Eucaliptol presente nesse óleo determinado por CLAE-DAD (27,9%), ou seja, 100% de eucaliptol equivale a 140 μg/mL. Esses valores foram usados como referência para o cálculo do teor em todas

as análises.

Tabela 4: Teor de eucaliptol (%) nas nanoemulsões no 1°, 30° e 60° dia, analisado por CLAE-DAD.

Amostras

Eucaliptol (%)

1° dia 30° dia 60°dia

NE 1 94,6±2,3 81,5±4,49 64,7 ± 2,1 NE 2 72,0±4,2 64,8±5,61 54,0 ± 4,6

Observou-se que o teor do eucaliptol no 1° dia, foi menor, para ambas as nanoemulsões, comparando-se com o valor teórico de eucaliptol (100%). Dessa forma, pode-se inferir que tenha ocorrido perda do óleo, possivelmente por volatilização, durante o preparo das formulações, caracterizada no presente trabalho pela redução do teor do marcador químico. Conforme o esperado, a metodologia que emprega o aquecimento para a obtenção das emulsões, apresentou menor teor de eucaliptol.

Houve uma diferença estatisticamente significativa no teor de eucaliptol durante o período estudado, para ambas as formulações (ANOVA, p<0,05). Durante a formação de emulsões, pode ser que nem todo o eucaliptol esteja presente no interior das micelas formadas, e se tratando de substâncias voláteis, pode-se supor que, uma vez que não estejam devidamente protegidas no interior das gotículas, a perda por volatilização será facilitada. Em sistemas emulsionandos sabe-se que uma parte do óleo deve estar na interface óleo/água, solubilizada na mistura de tensoativos. Essa redução significativa no teor de eucaliptol pode ainda ser explicada pelo mecanismo de maturação de Ostwald, relacionado à solubilidade da fase oleosa na fase aquosa, tendendo a fazer com que o óleo a migre para uma gotícula maior (NAZARZADEH et al., 2013). Durante esse processo é possível que parte do material de menor peso molecular como os monoterpenos ou até sesquiterpenos, como o eucaliptol, presentes no OERo se solubilizem na fase aquosa dispersante, tornando-se disponíveis para a volatilização.

Os resultados descritos oriundos do estudo de estabilidade podem ser usados também para a comparação entre as metodologias de baixo aporte energético empregadas neste trabalho. Na metodologia 1 as fases foram aquecidas e misturadas com agitação mecânica (400 rpm) durante 15 minutos,

obtendo massa final de 25g. Na metodologia 2, as fases, mantidas em temperatura ambiente, foram homogeneizadas sob agitação magnética (800 rpm) pelo período total de 1:03h, apresentando massa final de 10g. No presente estudo, ambos os tipos de homogeneização empregadas, magnética ou mecânica, parecem fornecer a mesma energia cinética para a formação do sistema emulsionado, uma vez que semelhantes tamanhos de gotículas foram obtidos. No entanto, tal semelhança se deu possivelmente em função da baixa massa total produzida na metodologia 2. A mesma energia cinética foi obtida com o dobro da velocidade e massa 2,5 vezes menor em comparação com a metodologia 1. Neste contexto, apesar dos resultados de teor sugerirem uma certa vantagem à metodologia 2, no sentido de manutenção dos componentes voláteis caracterizado pelo marcador eucaliptol, vale ressaltar a necessidade de futuros estudos de escalonamento a fim de comprovar a robustez dos métodos.

Outra diferença entre as metodologias a ser considerada é o tempo de homogeneização. Baseando-se nos resultados de teor do marcador químico pode-se sugerir que a perda deste componente majoritário do OERo se dá preferencialmente em função do aquecimento em relação ao tempo de agitação. A metodologia 1 apresentou perda de 28% de eucaliptol em relação ao calculado teoricamente após a manipulação. Nesta metodologia o óleo foi aquecido à 40ºC e a homogeneização feita por 15 min. Na metodologia 2, apesar da homogeneização ser mantida por mais de 1h, como as fases foram mantidas em temperatura ambiente, a perda inicial do marcador foi de apenas 6% em relação ao teórico esperado. Apesar disso, tais parâmetros não interferiram no tamanho das gotículas obtidas, na estabilidade final do sistema, nem mesmo na atividade anti-HSV descrita no item 5.6.

A relação entre os componentes água-óleo-tensoativos e as características intrínsecas aos agentes emulsionantes utilizados apresentam grande influência, uma vez que foi possível a obtenção de nanoemulsões estáveis por 60 dias através das duas técnicas, independentemente da origem do aporte energético. Ressalta-se com isso, a importância do emprego de metodologias de formulação no desenvolvimento de nanoemulsões com baixo aporte energético, tais como a do EHL crítico (FERNANDES et al., 2013), que alicerçou o presente estudo.

5.4 Avaliação do perfil de liberação in vitro do óleo de R. officinalis