Obtenção de hemolinfa

A hemolinfa foi coletada individualmente de 30 fêmeas transgênicas e 30 fêmeas selvagens (5 a 7 dias de idade) 24h e 36h após o repasto sanguíneo em camundongos anestesiados, em dois ciclos gonotróficos seguidos. Os mosquitos foram anestesiados em gelo e os primeiros pares anteriores de pernas foram arrancados. Em seguida foi injetado no tórax de cada fêmea com auxilio de agulhas confeccionadas a partir de capilares de vidro borosilicado (World Precision Instrument) aproximadamente 2 μL de tampão PBS 1X ((NaHPO4 7 mM, NaH2PO4 2mM, pH 7, NaCl 140 mM). A hemolinfa das 30 fêmeas transgênicas foi coletada em um mesmo capilar de 10 μL contendo uma solução de inibidores ProteoBlock™_{Protease Inhibitor Cocktail (Fermentas), transferida} para um tubo de microcentrífuga e armazenadas imediatamente a -80 °C. O mesmo procedimento foi realizado com as 30 fêmeas selvagens.

3.6.4 Cromatografia de fase reversa (RP-HPLC) acoplada a um espectrômetro de massas para análise da hemolinfa de fêmeas Aedes aegypti transgênicas

Amostras de microplusina recombinante foram utilizadas como padrão para confirmação de seu perfil ESI-MS e padrão de fragmentação. Para análise da massa molecular utilizou-se o software BioWorks Brownser 3.3 (Thermo Electron Corp.). As amostras de hemolinfa coletadas de um pool de 30 mosquitos foram dessalinizadas em micro colunas (Zip-Tip) com resina C18 (10µm, Vydac, EUA) antes das análises de espectrometria de massas, sendo utilizada uma solução acetonitrila 80% / ácido trifluoroacético 0,05% para a eluição das proteínas. As amostras foram secas em centrífuga a vácuo, ressuspendidas em 12 µL de solução 5% Acetonitrila / 0,2% Ácido fórmico e submetidas à cromatografia de fase reversa (RP-HPLC) acoplada a espectrometria de massas (LC-MS). A RP-HPLC foi realizada em colunas capilares C18 (100_{m x 25 cm) em um aparelho tipo ion trap Thermo Finnigan, modelo LCQ Duo™}

(Thermo Quest, EUA), equipado com uma nano-fonte de ionização do tipo “eletro-spray” (ESI-MS) e acoplado a um cromatógrafo líquido do tipo nano-HPLC modelo Ultimate LC Packings (Dionex Company, Amsterdam, Holanda). A calibração do equipamento foi realizada com soluções de cafeína (relação massa/carga (m/z) = 192,5), MRFA (m/z = 524,3) e Ultramark (m/z com valores de 1022, 1122, 1222, 1322, 1422, 1522, 1622, 1722, 1822 e 1922). O equipamento operou no modo de ionização positivo com

potencial de “eletro-spray” ajustado para 1.8 kV e temperatura do capilar aquecido ajustada para 180 o_{C. A cromatografia foi realizada sob um fluxo de 2 µL/min com} gradiente de acetonitrila em ácido fórmico 0,2% variando de 5% a 80% em 60min.

No espectrômetro de massas foi utilizado um método de dois eventos: primeiro evento full scan coletado do m/z 1000 ao m/z 2000 e segundo evento SRM (“Selected Reaction Monitoring”) que consistiu em selecionar o m/z 1458, fragmentar com energia de colisão 25% e monitorar os íons produto com os valores de m/z 1516, 1675, 1819 e janela de dectação de 1 m/z. Os dados foram coletados com o software Xcalibur® _2.0 (Thermo Electron Corp.).

Em cada amostra de hemolinfa de fêmeas selvagens foi adicionado 0,25 pmoles, 2,5 pmoles e 25 pmoles de microplusina recombinante para determinar o limite de detecção do método.

3.6.5 Experimento de bloqueio da infecção de Plasmodium gallinaceum em mosquitos transgênicos

Foram elaborados dois desenhos experimentais onde fêmeas transgênicas e selvagens realizaram um ou dois repastos sanguíneos, com o propósito de analisar o efeito da expressão da microplusina sobre esporozoítas de Plasmodium gallinaceum. Inicialmente um grupo de fêmeas transgênicas e selvagens de Aedes aegypti com 5 dias de idade e copuladas realizaram o repasto sanguíneo simultaneamente em pintainho

Gallus gallus domesticus infectado por Plasmodium gallinaceum.

No primeiro desenho experimental, as fêmeas realizaram um único repasto sanguíneo (infectado) e no 8º dia após o repasto sanguíneo, foram dissecados pares de glândulas salivares, quebradas individualmente em 10µl de PBS e o número de esporozoítas foi determinado sob microscopia de fase em câmara de Neubauer.

No segundo desenho experimental, 2 dias após o repasto sanguíneo (infectado), foi colocado dentro de cada copo onde os mosquitos estavam armazenados um recipiente contendo um pouco de água e pedaço de papel filtro revestindo a sua parede interna para que as fêmeas pudessem fazer a oviposição. No 5º dia as fêmeas realizaram o repasto sanguíneo em pintainho Gallus gallus domesticus não infectado e no 8º dia após o repasto sanguíneo infectado, foram dissecados pares de glândulas salivares, quebradas individualmente em 10µl de PBS e o número de esporozoítas foi determinado sob microscopia de fase em câmara de Neubauer.

3.6.6 Fitness de mosquitos Aedes aegypti transgênicos da linhagem pMOS[3xP3-eGFP-Micro] PM2

3.6.6.1 Longevidade

Para verificar a longevidade, fêmeas transgênicas de 1 dia de idade foram agrupadas e mantidas em gaiola. O mesmo foi feito para fêmeas selvagens, machos transgênicos e selvagens. Os mosquitos foram alimentados com sacarose 10% e a mortalidade foi observada todos os dias até que todos tivessem morrido. A observação da longevidade foi realizada em duplicata.

3.6.6.2 Fecundidade e fertilidade

Foram preparados cruzamentos de fêmeas transgênicas heterozigotas com machos selvagens, fêmeas selvagens com machos transgênicos heterozigotos e fêmeas e machos selvagens na proporção de indivíduos 1:1. Machos e fêmeas copularam por 2 dias e após este período, as fêmeas realizaram repasto sanguíneo de 30 minutos em camundongo anestesiado. Os mosquitos foram anestesiados em gelo para separação dos ingurgitados, mantendo-os com sacarose 3 M. No 3º dia após alimentação sanguínea as fêmeas foram novamente anestesiadas em gelo e colocadas individualmente em um tubo de vidro contendo no fundo algodão molhado com água, recoberto por um disco de papel filtro também umedecido para a oviposição. Este tubo foi tampado com um pedaço de tecido filó preso por elástico e os mosquitos foram mantidos com sacarose 3 M em estufa com temperatura média de 26 °C e 60% de umidade relativa do ar. No dia seguinte, as fêmeas foram retiradas dos tubos e os ovos contidos no disco de papel filtro e nas paredes do tubo foram contados. As fêmeas que não ovipuseram neste intervalo de tempo ou morreram foram consideradas estéreis. Após a contagem e secagem dos ovos, as posturas foram colocadas em recipientes plásticos individuais contendo o mesmo volume de água e quantidade de ração para a eclosão das larvas. Passados mais 5 ou 6 dias o número de larvas que eclodiram foi determinado.