Obtenção de lipossomas compostos de EPC/DOPE/DOTAP por

processamento “bottom-up”

Uma vez estabelecidas as condições apropriadas para o processamento “bottom-up” com o lipídeo EPC 60%, a formulação lipossomal destinada à vacinação gênica foi avaliada.

A viscosidade da dispersão de EPC/DOPE/DOTAP em etanol a 100 mM foi inferior àquela observada para dispersão de apenas EPC (60%) na mesma concentração e temperatura (1,07 cp e 1,21 cp, respectivamente). Consequentemente, o comportamento do foco hidrodinâmico formado com a utilização de EPC/DOPE/DOTAP foi diferente daquele observado com EPC (60%). Deste modo, optou-se por se realizar dois experimentos distintos em triplicata: o primeiro nas condições escolhidas anteriormente de QE de 0,007 mL/min e RÁGUA/ETANOL de 7,5 e o segundo com a mesma vazão de etanol/lipídio (0,007 mL/min), porém com RÁGUA/ETANOL que reproduzisse o foco hidrodinâmico obtido com a utilização de EPC (60%).

As condições de operação utilizadas e os resultados de características de superfície dos lipossomas obtidos estão apresentados na Tabela 16.

Tabela 16 Condições de operação selecionadas para produção dos lipossomas de EPC/DOPE/DOTAP em processamento “bottom-up”

Concentração inicial de

lipídio em etanol Vazão de etanol/lipídio RÁGUA/ETANOL

Diâmetro hidrodinâmico

médio cumulativo Polidispersidade Potencial zeta

(mM) (mL/min) (-) (nm) (-) (mV)

100 0,007 7,5 92,92 ± 10,14 0,441 ± 0,028 70,9 ± 4,64 100 0,007 10,57 162,10 ± 88,13 0,606 ± 0,157 57,0 ± 16,3

A Figura 43 mostra a diferença de focalização em microcanais com vazão de alimentação lipídio/etanol de 0,007 mL/min e RÁGUA/ETANOL de 7,5 e 10,57.

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Figura 43 Fotografias do sistema microfluídico no cruzamento dos canais (A e C) e ao final do dispositivo (B e D) nas condições de QE=0,007 mL/min e RÁGUA/ETANOL de 7,5 (A e B) e de 10,57 (C e D).

Ao final do dispositivo, ao contrário do que foi observado para o processamento com EPC (60%), não é possível enxergar a diferença entre a fase aquosa e orgânica, que desaparece ao longo do dispositivo (Figura 43 B e D). Este comportamento indica que todo o etanol inserido no sistema foi difundido para a fase aquosa e todo o lipídio foi exposto. Essa diferença de comportamento entre a injeção de apenas EPC e a de EPC/DOPE/DOTAP, ambos a 100 mM em etanol, pode ser explicada pela redução da viscosidade da dispersão lipídio/etanol e pela diferença de interação entre os lipídios dispersos e seus tamanhos da cabeça polar, que afetam a tensão de superfície na interface etanol/água. A mistura de lipídios também apresenta uma menor solubilidade, antecipando a concentração crítica dos lipídios no etanol, a partir da qual ocorre a vesiculação e a formação dos lipossomas. Além disso, a cabeça polar do DOTAP é carregada positivamente, proporcionando uma saturação mais rápida da interface

99 etanol/água. Estes fatores influenciam na resistência à transferência de massa do etanol na água.

A Figura 44 apresenta os gráficos de distribuição de tamanho por intensidade de luz espalhada e número de partículas para lipossomas compostos de EPC/DOPE/DOTAP obtidos por processamento “top-down” e pelas condições de processamento “bottom-up” vistas na Tabela 16.

0 10 20 30 40 0.1 1 10 100 1000 10000 0 5 10 15 20 0.1 1 10 100 1000 10000 0 5 10 15 0.1 1 10 100 1000 10000 0 10 20 30 40 0.1 1 10 100 1000 10000 0 5 10 15 20 25 0.1 1 10 100 1000 10000 0 10 20 30 40 50 0.1 1 10 100 1000 10000 N ú m e ro d e p a rt íc u la s (% e m c la ss e ) A I) Distribuição em termos de Intensidade de luz espalhada II) Distribuição em termos de número de partícula

Diâmetro (nm) Diâmetro (nm) In te n si d a d e (% e m c la ss e ) B B A C C

Figura 44 Distribuição de tamanhos em termos de intensidade de luz espalhada (I) e número de partículas (II) (% em classe de tamanhos) para os lipossomas compostos de EPC/DOPE/DOTAP. Distribuição em termos de intensidade de luz espalhada: A) lipossomas formados via processamento “top-down” (lipossomas pré-formados via Ultra-Turrax® com diâmetro hidrodinâmico médio de 246,5 e posteriormente microfluidizados com pressão de alimentação de 850 bar e 2 passagens); B) lipossomas formados via processamento “bottom-up” com concentração de lipídio em etanol de 100 mM, QE de 0,007 mL/min e

RÁGUA/ETANOL de 7,5 e C) lipossomas formados via processamento “bottom-up” com concentração de lipídio

em etanol de 100 mM, QE de 0,007 mL/min e RÁGUA/ETANOL de 10,57. Cada curva indica medida obtida por

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Comparando os gráficos de distribuição de tamanho, verifica-se que a polidispersidade dos lipossomas obtidos através de processamento “bottom-up” foi superior a dos lipossomas produzidos via processamento “top-down”, observado pelo maior número de populações de tamanhos (distribuição de intensidade de luz espalhada). Porém, pelo gráfico de distribuição em termos de número de partículas, há a predominância de apenas uma população para todos os casos vistos na Figura 44, e que o tamanho predominante dos lipossomas produzidos via injeção cruzada em microcanais é menor que os formados via processamento “top-down”.

A Tabela 17 mostra uma comparação dos resultados de diâmetro hidrodinâmico médio cumulativo, polidispersidade e potencial zeta de lipossomas compostos de EPC/DOPE/DOTAP obtidos através de processamento “top-down” e “bottom-up” com os requerimentos estabelecidos por Torre (2006) para a vacinação gênica contra a TB. É importante ressaltar que não é aconselhado comparar os valores de diâmetro hidrodinâmico médio cumulativo obtidos através de processamentos distintos (item 4.4.1). Portanto, para a comparação de tamanho de partícula, devem ser analisados os gráficos de distribuição de tamanho (Figura 44). Os dados do processamento “bottom- up” foram dos lipossomas obtidos nas condições de QE de 0,007 mL/min e RÁGUA/ETANOL de 10,57

Tabela 17 Comparação dos resultados requeridos de diâmetro médio e polidispersidade para lipossomas compostos de EPC/DOPE/DOTAP para a vacinação gênica contra a TB, com os resultados obtidos por processamento “top-down” e “bottom-up”.

Diâmetro hidrodinâmico

médio cumulativo Polidispersidade

(nm) (-) Requerimentos estabelecidos por Torre (2006) 100 a 130 ≤ 0,3 "Top-down" 121,8 ± 7,1 0,270 ± 0,010 "Bottom-up" 92,92 ± 10,14 0,441 ± 0,028 Processamento

101 Os resultados dos dois tipos de processamento mostram que através de processamento em microcanais, nas condições estudadas de concentração inicial de lipídio em etanol e vazões de alimentação de lipídio/etanol e água, é possível obter lipossomas com um diâmetro hidrodinâmico médio cumulativo inferior ao requerido para a produção de lipossomas pré-formados e extrudados em fase anterior à complexação com o DNA. Já a polidispersidade está superior ao estabelecido por Torre (2006), o que limita a utilização destes lipossomas na aplicação desejada. Portanto, pode-se observar que há similaridades nos dois parâmetros diâmetro e polidispersidade para os lipossomas obtidos através de processamento “bottom-up”. Como a eficiência ótima dos lipossomas para uma determinada aplicação situa-se em uma faixa estreita de tamanhos e polidispersidade, estes resultados mostram-se promissores para a associação com DNA e produção da vacina gênica lipossomal para a Tuberculose. No entanto, esta conclusão deverá ser validada através de ensaios in vivo.

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