Obtenção do duplo mutante ∆adh1 e ∆tpi1

Como não foi possível a

dificuldades encontradas na transformação, foi duplo mutante. Essa estratégia foi

se encontram em cromossomos separados e

genes ADH1 e TPI1 foram deletados em duas linhagens de laboratório e duas linhagens industriais, de diferentes mating-type, foi possível re

(FY86 ∆adh1 ADH1-HYG) foi cruzada com a AZY331 (FGY031 ∆adh1 ADH1-HYG

KAN). Após os cruzamentos é esperado que a linhagem se torne diplóide

cópia dos gene ADH1 e TPI1 e apresente resistência à higromicina e geneticina. Sendo assim, p isolamento de colônias após o cruzamento foi utilizado o meio sólid

higromicina, no qual apenas as linhagens com ambos os casset

capazes de crescer. Após o crescimento de colônias isoladas, foi realizado um PCR de colônia para determinar o mating-type e verificar se re

amplificação de um fragmento de

linhagens dipóides há a amplificação de ambos os fragmentos. Como pode ser

48. Algumas linhagens são diplóides, comprovando que o cruzamento realmente ocorreu.

Figura 48. Confirmação do cruzamento das linhagens AFY322 X AFY412 e AZY331 X AZY441 por PCR do

mating-type. Marcador de massa molecular O’GeneRuler 100 pb Plus DNA Ladder (Fermentas), amplificação

da linhagem diplóide JAY 270 (+), colônias do cruzamento AFY322 X AFY41 do cruzamento AZY331 X AZY441.

Após a comprovação do cruzamento,

com o intuito de encontrar algum esporo que possuísse os genes

colônias foram incubadas em meio de esporulação para que fossem formadas as tétrades de esporos. O isolamento dos esporos normalmente é

das tétrades em microscópio com micromanipulador. Essa foi a técnica utilizada inicia isolamento dos esporos, entretanto, até que se adquira prática, é uma técnica demorada

∆adh1 e ∆tpi1

deleção de ambos os genes na mesma levedura,

dificuldades encontradas na transformação, foi desenvolvida outra estratégia para a obtenção do . Essa estratégia foi baseada em cruzamentos e esporulações, uma vez que os genes se encontram em cromossomos separados e, portanto, a segregação é independente

foram deletados em duas linhagens de laboratório e duas linhagens industriais, , foi possível realizar o cruzamento dessas linhagens. A linhagem AFY322 ) foi cruzada com a linhagem AFY412 (FY23 ∆tpi1 TPI1

HYG) foi cruzada com a linhagem AZY441 (FGY042 . Após os cruzamentos é esperado que a linhagem se torne diplóide, mas possua apena

e apresente resistência à higromicina e geneticina. Sendo assim, p isolamento de colônias após o cruzamento foi utilizado o meio sólido YEPE com geneticina e

apenas as linhagens com ambos os cassetes, e, portanto

Após o crescimento de colônias isoladas, foi realizado um PCR de colônia para e verificar se realmente houve o cruzamento. Em linhagens

amplificação de um fragmento de 544 pb, em linhagens de MATα um fragmento de 404 pb e em linhagens dipóides há a amplificação de ambos os fragmentos. Como pode ser visualizado na

Algumas linhagens são diplóides, comprovando que o cruzamento realmente ocorreu.

nfirmação do cruzamento das linhagens AFY322 X AFY412 e AZY331 X AZY441 por PCR do molecular O’GeneRuler 100 pb Plus DNA Ladder (Fermentas), amplificação da linhagem diplóide JAY 270 (+), colônias do cruzamento AFY322 X AFY412, reação sem DNA (B), colônias

Após a comprovação do cruzamento, foi realizada a esporulação de várias algum esporo que possuísse os genes ADH1 e TPI1

cubadas em meio de esporulação para que fossem formadas as tétrades de ros normalmente é realizado manualmente através da dissecação das tétrades em microscópio com micromanipulador. Essa foi a técnica utilizada inicia

isolamento dos esporos, entretanto, até que se adquira prática, é uma técnica demorada

68 deleção de ambos os genes na mesma levedura, devido às estratégia para a obtenção do , uma vez que os genes segregação é independente. Como os foram deletados em duas linhagens de laboratório e duas linhagens industriais, . A linhagem AFY322 TPI1-KAN) e a linhagem ) foi cruzada com a linhagem AZY441 (FGY042 ∆tpi1 TPI1-

mas possua apenas uma e apresente resistência à higromicina e geneticina. Sendo assim, para o YEPE com geneticina e portanto, diplóides foram Após o crescimento de colônias isoladas, foi realizado um PCR de colônia para Em linhagens MATa há a um fragmento de 404 pb e em visualizado na Figura Algumas linhagens são diplóides, comprovando que o cruzamento realmente ocorreu.

nfirmação do cruzamento das linhagens AFY322 X AFY412 e AZY331 X AZY441 por PCR do molecular O’GeneRuler 100 pb Plus DNA Ladder (Fermentas), amplificação 2, reação sem DNA (B), colônias

foi realizada a esporulação de várias colônias diplóides, TPI1 deletados. As cubadas em meio de esporulação para que fossem formadas as tétrades de através da dissecação das tétrades em microscópio com micromanipulador. Essa foi a técnica utilizada inicialmente para o isolamento dos esporos, entretanto, até que se adquira prática, é uma técnica demorada e laboriosa.

69 Como o objetivo da esporulação era a obtenção de um esporo duplo mutante, não sendo necessário saber de qual tétrade provinha, nem qual o genótipo dos esporos irmãos, optou-se por utilizar a técnica do Random Spore Analysis. Essa técnica consiste na liberação dos produtos da meiose pelo rompimento por sonicação das tétrades. Entretanto, também pode ocorrer contaminação por linhagens diplóides não esporuladas.

As células liberadas após o rompimento das tétrades foram contadas e plaqueadas em meio YEPE com geneticina e higromicina para que apenas os esporos duplos mutantes crescessem. Após o crescimento de colônias no meio seletivo foi determinado o mating-type por PCR de colônia para verificar se realmente eram esporos ou apenas linhagens diplóides não esporuladas. Como pode se visualizado na Figura 49. O isolamento de esporos foi bem sucedido, tanto de MATa quanto MATα, havendo apenas poucas colônias referentes às células diplóides.

Figura 49. Confirmação da obtenção de esporos por Random Spore Analysis por PCR do mating-type. A. Marcador de massa molecular O’GeneRuler 100 pb Plus DNA Ladder (Fermentas), reação sem DNA (B), amplificação da linhagem diplóide JAY 270 (+) e esporos do cruzamento AZY331 X AZY441. B. Marcador de massa molecular O’GeneRuler 100 pb Plus DNA Ladder (Fermentas), reação sem DNA (B) e esporos do cruzamento AFY322 X AFY412.

Para confirmação de que essas linhagens haplóides possuíam tanto o gene ADH1 quanto o gene TPI1 deletados foram realizados PCRs de colônia utilizando os primers Conf-ADH1_Int-F e Conf-ADH1_Int-R, para verificação do locus ADH1 (496 pb), e Conf-TPI1_Int-F e Conf-TPI1_Int-R para verificação do locus TPI1 (515 pb). Como pode ser observado na Figura 50 as linhagens haplóides realmente possuem os dois genes deletados, confirmando a obtenção tanto de duplos mutantes industriais quantos de laboratório. Essas linhagens foram renomeadas para AFY (linhagens de laboratório) ou AZY (linhagens industriais) e são apresentadas na Tabela 8, juntamente com uma breve descrição de genótipo.

Figura 50. Confirmação da obtenção de

Marcador de massa molecular O’GeneRuler 100 pb Plus DNA Ladder (Fermentas), reação sem DNA (B) linhagem selvagem (-), linhagem ∆adh1

X AZY441, linhagens haplóides provenientes do cruzamento AFY322 X AFY412, marcador de O’GeneRuler 100 pb Plus DNA Ladder (Fermentas), reação sem DNA (B), linhagem sel

∆tpi1, 515 pb, (+), linhagens haplóides provenientes do cruzamento AZY331 X AZY441 e linhagens haplóides

provenientes do cruzamento AFY322 X AFY412.

Tabela 8. Nome, origem e descrição breve das características genotípicas das linhagens

Nome* Origem

AFY731 AFY322 X AFY412 colônia 1 AFY732 AFY322 X AFY412 colônia 3 AZY771 AZY331 X AZY441 colônia 1 AZY772 AZY331 X AZY441 colônia 2

* O primeiro número da linhagem corresponde ao gene deletado (3 segundo número corresponde à linhagem (1

cruzamentos correspondem à soma dos números das linhagens originais . O terceiro número corresponde aos diferentes indivíduos com as mesmas modificações.