Obtenção e infecção “ex vivo” dos hemócitos de Rhodnius prolixus

Para os experimentos de interação ex vivo, os hemócitos foram obtidos a partir da hemolinfa de exemplares adultos de R. prolixus obtidos do insetário do Laboratório de Protozoologia da UFSC. Os

insetos foram mergulhados em etanol 70% por 15 minutos e, após lavagem com PBS estéril, tiveram uma de suas patas seccionadas e a hemolinfa gotejada diretamente sobre 1 ml de meio Schneider pH 7,4 suplementado com 20 % de SBF em lamínulas de vidro circulares (13mm) dispostas em placas de 24 poços.

O número de insetos utilizados para a coleta de hemolinfa por poço era variável de acordo com a quantidade de hemolinfa retirada de cada triatomíneo. Como regra geral, utilizou-se a confluência do fundo do poço como parâmetro, uma vez que é necessário levar em consideração a grande quantidade de outras células encontradas na hemolinfa além dos hemócitos e também o fato de que nem todas iriam permanecer viáveis para o experimento. Após 24 horas a 26oC, as lamínulas foram lavadas com PBS estéril para remoção das células não aderentes, sendo novamente suplementadas com 1 ml de meio Schneider pH 7,4 suplementado com 20 % de SBF.

Determinando-se que havia cerca de 2 x 105 hemócitos por poço, utilizamos um M.O.I. (razão parasito/célula) de 5:1, sendo que a infecção dos hemócitos pelos parasitos seria avaliada nos tempos 0, 24, 48 e 120 horas.

Para infecção dos hemócitos, formas epimastigotas de T.

rangeli Choachí GFP foram lavadas duas vezes em PBS e adicionadas

de meio de cultura Schneider pH 7,4 contendo 20 % de SBF e tiveram sua quantidade ajustada para 106 parasitos/poço (5: 1 parasitos/célula), sendo distribuídos 1ml da suspensão de parasitos por poço, sendo os ensaios realizados em duplicata.

Decorridos os tempos de infecção acima determinados, as lamínulas eram observadas diretamente por microscopia de fluorescência e, posteriormente, o poço era lavado duas vezes com PBS e as células fixadas com metanol por 60 segundos e coradas pelo método de Giemsa. Após a secagem, as lamínulas foram montadas de forma invertida sobre lâminas de microscopia com Entellan®. Os resultados das observações a fresco das infecções e das lamínulas coradas por Giemsa foram registrados por microscopia de fluorescência em microscópio IX 71 e BX 40, Olympus.

4.7.1 Ensaio de infecção de hemócitos de R. prolixus com T. rangeli Choachí GFP tratados com Lisotracker®

Buscando verificar o envolvimento de lisossomos dos hemócitos na interação ex-vivo com o T. rangeli, utilizamos o marcador fluorescente Lysotracker Red DND-99® (Life Technologies).

Para tanto, exemplares adultos de R. prolixus foram inoculados diretamente na hemolinfa com 100 µl de formas epimastigotas de T.

rangeli Choachí GFP em fase exponencial de crescimento. Decorridas

duas semanas da inoculação, foi verificada a colonização da hemolinfa pelos parasitos, sendo a mesma coletada conforme o descrito em no item 4.7., adicionando-se 60 nM do reagente Lisotracker e incubando-se a 27,5 ºC por 2 h ao abrigo da luz. Após lavagem das lamínulas com PBS pH 7,4, as mesmas foram montadas de forma invertida sobre lâminas de microscopia com o reagente Hydromount. Os resultados foram observados em microscópio de fluorescência BX 40, Olympus, e registrados digitalmente.

Como controle neste experimento utilizamos hemócitos de insetos não infectados e células THP-1 não infectadas e infectadas com

T. cruzi a fim de permitir a realização de uma análise comparativa do

padrão de distribuição e/ou migração lisossomal. 4.8 Camundongos

Camundongos Balb/C oriundos do Biotério Setorial do MIP/ UFSC foram utilizados nos experimentos. Os animais foram mantidos em caixas com lotação máxima de até cinco camundongos, acondicionados em estantes com sistema de filtração de ar acoplado individualmente por gaiola. Os animais foram alimentados ad libitum com ração irradiada e autoclavada e água filtrada e autoclavada, sendo mantidos em ciclo natural de iluminação. Todos os procedimentos foram realizados na observância dos preceitos estabelecidos pelo Colégio Brasileiro de Experimentação Animal – COBEA, tendo sido o projeto aprovado pela Comissão de Ética em Uso de Animais da UFSC (Protocolo PP00822 - Ofício 120 / CEUA / PRPE/2012).

4.8.1 Ensaio de infecção no hospedeiro mamífero

Grupos de oito camundongos fêmeas da linhagem Balb/C com quatro semanas de idade foram inoculados via intraperitoneal (i.p.) com 2x106 formas tripomastigotas de T. rangeli Choachí RFP e 1x104 formas tripomastigotas de T. cruzi Y GFP. Os grupos experimentais foram organizados da seguinte forma:

 Não infectados

 Infectados com T. cruzi Y WT

 Infectados com T. cruzi Y GFP

 Infectados com T. rangeli Choachí WT

 Co-infectados com ambos os parasitos

 Infectados inicialmente com T. rangeli e após 15 dias infectados com T. cruzi

 Infectados inicialmente com T. cruzi e após 15 dias infectados com T. rangeli

4.8.2 Avaliação da parasitemia no hospedeiro mamífero

A parasitemia dos animais infectados foi determinada diariamente pelo método descrito por Brener (1962) até que não fossem mais detectada parasitemia por exame ao microscópio óptico convencional e ao microscópio de fluorescência.

4.8.3 Avaliação histopatológica do hospedeiro mamífero

Para as análises histopatológicas, um ou dois animais de cada grupo foram sacrificados no 15°, 35° e 50° dias pós-infecção. Para tanto, os animais foram anestesiados, os camundongos foram anestesiados com cloridrato de cetamina (Dopalen®) e cloridrato de xilazina (Rompum®) e em seguida foi realizada punção cardíaca para coleta de sangue e soro. Amostras dos tecidos (coração, fígado, baço e músculo esquelético) foram retiradas de cada animal e divididas em três frações, sendo uma parte fixada em formalina 10% tamponada para estudos histopatológicos (cortes seriados de 3 µm corados pela hematoxilina eosina - HE), outra parte submetidas à técnica de congelamento rápido, seccionadas através de um criostato para a observação da presença de dos parasitos transfectados em microscópio de fluorescência e a terceira parte armazenada em etanol 70% para extração de DNA. Na análise histopatológica, cinco lâminas para cada animal foram avaliadas em microscopia convencional em objetiva de 10x, 40x e 100x, para pesquisa de parasitos intra ou extracelulares e avaliação de reação inflamatória nos tecidos em comparação com o grupo controle não infectado. A intensidade de inflamação foi dada de acordo com critérios histopatológicos. Os experimentos de análise histopatológica foram realizados em colaboração com o Prof. Dr. Álvaro Menin do Instituto de Diagnóstico Veterinário (VERTA) de Curitibanos, SC.

5. RESULTADOS