Obtenção de peptídeos bioativos por simulação da digestão ou hidrólise enzimática

Saber se os peptídeos potencialmente bioativos resistem ao processo de digestão, ou identificar quais novos PBAs são liberados de um determinado produto através da digestão, é importante para o desenvolvimento de novos produtos lácteos com benefícios para a saúde (KOPF-BOLANZ et al., 2014).

Atividades de PBAs testadas a partir de extratos alimentícios e peptídeos bioativos em experimentos gastrointestinais são duas importantes fatores que precisam ser considerados (JIN et al., 2016). Como exemplo, a lactoquinina, um peptídeo resultante da clivagem da β- lactoglobulina, β-Lgf (142-148) que exibiu atividade inibitória in vitro contra a enzima conversora de angiotensina (ECA), demonstrou-se insuficientemente estável contra proteases do trato gastrointestinal. E após a simulação da digestão, a atividade residual anti-ECA foi completamente reprimida quando o peptídeo foi incubado com sangue humano, provando que proteinases e peptidases de soro degradam ainda mais os peptídeos circulantes (PICARIELLO

et al., 2010).

Os peptídeos bioativos podem ser liberados durante a digestão gastrointestinal pela ação de enzimas digestivas como a pepsina, tripsina ou quimotripsina. As proteínas dietéticas sofrem desnaturação na presença de ácido clorídrico secretado pelas células parietais do estômago. Este ácido, ativa o pepsinogênio e converte-o em sua forma ativa, a pepsina. A pepsina atua em proteínas metabolizando-as em peptídeos e aminoácidos. A digestão

gastrointestinal permite a consequente ação das enzimas presentes no intestino delgado, tais como tripsina ou quimotripsina, que são responsáveis pela hidrólise de proteínas (MOHANTY et al., 2016).

Nas digestões gastrointestinais, as enzimas apresentam certas preferências para as proteínas do leite. Segundo o estudo de Jin et al. (2016) a β-caseína foi a proteína que liberou mais peptídeos durante a digestão gastrointestinal de um iogurte. O número de peptídeos liberados de caseínas foi consistente com o trabalho de Dupont et al. (2010) que relatam que a ordem de liberação de caseína em ensaios gastrointestinais é β-CN >αs1->αs2-CN > κ-CN. As enzimas intestinais eram propensas a digerir β-CN, enquanto a clivagem da proteína κ-CN é preferida pelas bactérias ácido láticas. A fermentação ajuda a pré- hidrolisar κ-CN que não é facilmente hidrolisado nos ensaios gastrointestinais (JIN, Y. et al., 2016).

Vários PBAs (isto é, antibacterianos, imunomoduladores, anti-hipertensivo e opióides) são conhecidos por liberados de caseína e/ou soro de leite, proteínas por digestão gastrointestinal (HARTMANN; MEISEL, 2007; PICARIELLO et al., 2010; JIN et al., 2016; MOHANTY et al., 2016).

A hidrólise enzimática é uma das técnicas mais rápidas, mais seguras e mais facilmente controladas para a produção de PBAs e pode ser usada para melhorar as propriedades funcionais e biológicas das proteínas, além de agregar valor aos subprodutos com baixo valor comercial (BRANDELLI; DAROIT; CORRÊA, 2015; CORRÊA et al., 2014; MEIRA et al., 2012). As proteases catalisam a hidrólise de ligações peptídicas em proteínas e podem atuar sobre as ligações éster e amida. Todas as proteases têm um certo grau de especificidade para o substrato, geralmente com base na sequência de aminoácidos que circundam diretamente a ligação que é clivada (UDENIGWE; FOGLIANO, 2017).

A especificidade enzimática e as condições de hidrólise (pH, temperatura, tempo) influenciam o tamanho e as sequências de aminoácidos nas cadeias peptídicas, bem como a quantidade de aminoácidos livres, que podem afetar a atividade biológica dos hidrolisados (SARMADI; ISMAIL, 2010).

Na revisão de Saavedra et al. (2013) foi citado um peptídeo de 25 aminoácidos derivado da digestão da lactoferrina por pepsina, que apresentou uma excelente atividade antimicrobiana. A digestão da α-lactalbumina por pepsina, tripsina ou quimotripsina resulta na produção de PBAs com ambas as atividades imunomoduladoras e antimicrobianas contra bactérias, vírus e fungos.

O composto bioativo derivado do soro de leite é o tripeptídeo Ile-Pro-Ala, liberado da hidrólise de β-lactoglobulina, que pode atuar como inibidor de dipeptidil peptidase-4, reduzindo os níveis de glicose e estimulando a insulina (BRANDELLI; DAROIT; CORRÊA, 2015). Outros tripeptídeos derivados da β-caseína Ile-Pro-Pro e Val-Pro-Pro, por ação de uma protease encontrada em L. helveticus, apresentaram capacidade anti-hipertensiva quando testados em ratos naturalmente hipertensos (MIYAZAKI et al., 2017).

A literatura atual mostra que os peptídeos derivados de hidrolisados enzimáticos de proteínas alimentares possuem notáveis atividades multifuncionais relevantes para o sustento da saúde humana (NIELSEN et al., 2017). Esta área de pesquisa está crescendo continuamente com a descoberta de novos alvos de doenças moleculares. Embora existam muitas informações sobre os vários PBAs derivados de proteínas alimentares, os futuros esforços de pesquisa devem ser direcionados para a avaliação de efeitos de promoção da saúde in vivo, biodisponibilidade e farmacocinética em indivíduos humanos, elucidação dos mecanismos moleculares de ação e em geral possível uso como agentes promotores da saúde em sistemas alimentares (UDENIGWE; ALUKO, 2012).

3 OBJETIVOS

Geral

Caracterizar os microrganismos, a bioquímica e a funcionalidade do leite de ovelha fermentado por grãos de kefir após o processo de digestão in vitro.

Específicos

• Produzir o leite fermentado utilizando como matéria prima leite UHT e leite de ovelhas mestiças da raça Bergamácia e grãos de kefir segundo a Patente BR 10 2013 015842-9; • Realizar a digestão in vitro do leite UHT e leite de ovelha fermentado pelos grãos de kefir; • Examinar os efeitos do processo de digestão in vitro dos leites fermentados sobre a

composição microbiana e os peptídeos gerados a partir deste produto;

• Isolar bactérias e leveduras após o processo de digestão in vitro e avaliar as propriedades probióticas destes microrganismos;

• Caracterizar e identificar os microrganismos isolados após o processo de digestão in vitro; • Avaliar a capacidade antagônica dos microrganismos isolados, na inibição de bactérias

patogênicas;

• Estimar a atividade antioxidante dos microrganismos isolados após o processo digestivo; • Verificar se os microrganismos isolados produzem a enzima β-galactosidase e quantificar

a atividade enzimática;

• Observar a capacidade de adesão dos microrganismos isolados por meio de testes de auto- agregação, hidrofobicidade e adesão em células epiteliais de intestino de camundongos; • Verificar o perfil peptídico dos peptídeos extraídos antes e após o processo de digestão in

vitro por eletroforese monodimensional (SDS-PAGE);

• Extrair os peptídeos do leite fermentado após processo de digestão in vitro por ultrafiltração;

• Identificar o perfil dos peptídeos extraídos por ultrafiltração a partir dos eventos de digestão in vitro do leite de ovelha fermentado por grãos de kefir por espectrometria de massas (Maldi-ToF) e comparar com a literatura os principais íons observados;

• Avaliar as atividades antimicrobiana, antioxidante, anti-hipertensiva e anti-hemolítica dos peptídeos extraídos por ultrafiltração do leite de ovelha fermentado por grãos de kefir

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