Obtenção e Preparo do Hidrolisado de Palha de Arroz

A palha de arroz utilizada nos experimentos foi obtida na região de Lorena. Após o recebimento, a palha foi seca ao sol e cominuída em moinho tipo martelo até um tamanho de aproximadamente 1 cm de comprimento e 1 mm de espessura. O hidrolisado hemicelulósico foi obtido por catálise ácida em reator confeccionado em aço-inox AISI 316 com capacidade de 350 L., munido de aquecimento indireto por resistência elétrica por camisa de óleo térmico. As reações foram realizadas a 121 ºC por 27 min, empregando uma relação solução ácida:palha seca de 10 g/g. Foi utilizado o H2SO4 como

catalisador e a solução ácida foi preparada para concentração final de 1% (ROBERTO et al., 2003). Ao final da reação, o material descarregado do reator foi centrifugado e a fração líquida recuperada (hidrolisado hemicelulósico).

Para o hidrolisado tratado, a fração líquida recuperada foi retornada ao reator de hidrólise para destoxificação do hidrolisado com carvão ativo nas seguintes condições: proporção carvão:hidrolisado de 3% (p/v), temperatura de 45 ºC e tempo de agitação de 30 min (MUSSATTO e ROBERTO, 2001). Após o processo de adsorção com carvão ativo, a mistura foi centrifugada para remoção de sólidos.

O hidrolisado não tratado (H) e o hidrolisado destoxificado (HD), foram então submetidos ao processo de concentração (HC e HDC, respectivamente),

sob vácuo, em evaporador com capacidade de 4 litros, a uma temperatura de 65 ºC de forma a obter a concentração de xilose de aproximadamente 90,0 g/L, e em seguida estocados a 4 ºC para posterior utilização nos ensaios de fermentação.

Foi feita uma caracterização dos hidrolisados, através de cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC), para a determinação de alguns dos compostos presentes no meio e através de espectrofotometria (UV-visível), na qual foi determinada a concentração total dos compostos fenólicos constituintes, utilizando-se do método de Folin - Ciocalteau (padrão vanilina) e de determinação de unidades arbitrárias de absorbância (280 nm). O valor de pH também foi determinado.

4.4.1. Condições de Fermentação do Hidrolisado Hemicelulósico de Palha de Arroz

As condições de fermentação para o cultivo em hidrolisado (HC e HDC) foram definidas após os resultados obtidos com os cultivos em meio semi- sintético (concentração celular inicial de 3,0 g/L e pH 5,5). O pH do hidrolisado foi elevado para 5,5 com adição de NaOH em pellets, sendo em seguida centrifugado a 2000xg por 20 min para a remoção do precipitado resultante. Nesta etapa, o hidrolisado não foi suplementado com os nutrientes empregados em meio semi-sintético.

Para a fermentação em hidrolisado hemicelulósico destoxificado suplementado com vanilina (HDV), o composto fenólico (1,6 g/L) foi adicionado ao hidrolisado logo após a correção do pH e remoção do precipitado por centrifugação. A suplementação com vanilina foi feita minutos antes da inoculação, e sua total solubilização no hidrolisado foi conseguida mediante aquecimento do meio em banho-maria.

O processo fermentativo foi conduzido em frascos Erlenmeyer de 250 mL contendo 100 mL do meio de cultivo, inoculados com células cultivadas nas condições descritas para o preparo do inóculo. Os frascos foram incubados a 30 ºC, em agitador metabólico, sob agitação de 200 rpm.

Durante a fermentação, amostras foram retiradas periodicamente, em 0, 48, 72 e 96 h, para o acompanhamento do teor de compostos fenólicos (vanilina, siringaldeído, ácido vanílico, álcool vanilil, ácido siríngico e ácido ferúlico), ácido acético, furfural, xilose, glicose, xilitol e de células e variação do pH. O pH foi determinado segundo o item 4.5.2.

4.5. Métodos Analíticos

4.5.1. Determinação da Concentração Celular

A concentração celular foi obtida mediante uma curva de calibração que correlaciona densidade ótica (DO) com massa seca de células. Para a elaboração desta curva, células provenientes do cultivo de 50 mL de inóculo, foram centrifugadas a 2000xg por 20 min. O sobrenadante foi descartado e as células lavadas pelo menos 2 vezes com água destilada. Em seguida, as células foram ressuspensas em água destilada de forma a se obter uma suspensão homogênea densa (suspensão original), a qual foi utilizada para preparar suspensões com diversas diluições. As suspensões diluídas foram submetidas à leitura de absorbância em espectrofotômetro (Beckman DU 640) a 600 nm, utilizando-se água destilada como branco. A massa seca foi determinada a partir da suspensão original após secagem de alíquotas de 5 mL, em estufa a 105 ºC por 24 h.

4.5.2. Determinação do pH

Os valores de pH foram determinados por potenciometria, por meio de um aparelho da marca MICRONAL modelo B474, com correção de temperatura.

4.5.3. Determinação da Concentração de Glicose, Xilose, Arabinose, Xilitol, Glicerol, Ácido acético, e Etanol

As concentrações de glicose, xilose, arabinose, xilitol, glicerol, acético acético e etanol foram determinadas por Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC), em equipamento WATERS, nas seguintes condições: coluna BIO-RAD Aminex HPX-87H (300 x 7,8 mm); temperatura: 45 ºC; eluente: ácido sulfúrico 0,01 N desgaseificado; fluxo: 0,6 mL/min; volume de amostra: 20 μL; detector: índice de refração.

Como preparo, as amostras foram primeiramente centrifugadas a 1800xg por 20 min para a remoção das células, sendo os sobrenadantes recolhidos e apropriadamente diluídos com água deionizada. Numa etapa posterior as amostras já diluídas foram passadas por filtros C18 SEP-PACK CARTRIDGE (Waters Associates - MILIPORE). As concentrações destes compostos foram calculadas a partir de curvas de calibração obtidas de soluções padrão.

4.5.4. Determinação da Concentração de Furfural e 5-Hidroximetilfurfural

As concentrações de furfural e 5-hidroximetilfurfural foram determinadas por Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC), em equipamento WATERS, na seguintes condições: coluna Waters R es olve C18 5 ì m (3,9 x 300 mm); temperatura ambiente; eluente: acetonitrila/água (1/8 com 1% de ácido acético) desgaseificado; fluxo: 0,8 mL/min; volume de amostra: 20 ì L e detector: UV a 276 nm.

Inicialmente, as amostras foram centrifugadas a 1800xg por 20 min para a remoção das células. Os sobrenadantes foram recolhidos e passados por uma membrana do tipo HAWP 04700 com poros de 0,45 ì m (Waters Associates - MILIPORE). As concentrações destes compostos foram calculadas a partir de uma curva de calibração obtida de soluções padrão.

4.5.5. Determinação da Concentração dos Compostos Fenólicos por

As concentrações de vanilina, álcool vanilil, ácido vanílico, siringaldeído, ácido siríngico e ácido ferúlico, foram determinadas por Cromatografia Líquida de Alto Desempenho (HPLC), em equipamento WATERS, na seguintes condições: coluna Waters Resolve C18 5 ì m (3,9 x 300 mm); temperatura ambiente; eluente: acetonitrila/água (1/8 com 1% de ácido acético) desgaseificado, com adição de ácido fosfórico para correção do pH para 2,5; fluxo: 0,9 mL/min; volume de amos tra: 20 ì L e detector: UV a 276 nm.

As amostras foram centrifugadas a 1800xg por 20 min para a remoção das células. Os sobrenadantes foram recolhidos e passados por uma membrana do tipo HAWP 04700 com poros de 0,45 ì m (Waters Associates - MILIPORE). As concentrações destes compostos foram calculadas a partir de uma curva de calibração obtida de soluções padrão.

4.5.6. Determinação dos Compostos Fenólicos Totais por Espectrofotometria UV-visível

A concentração total dos compostos fenólicos foi quantificada colorimetricamente pelo método modificado de Folin-Ciocalteau (SINGLETON et

al., 1999)usando a vanilina como padrão de calibração.

Inicialmente, as amostras foram centrifugadas a 1800xg por 20 min para a remoção das células. Os sobrenadantes foram recolhidos e passados primeiramente por um filtro de 0,45 ì m, para remoção de possíveis interferentes, sendo em seguida diluídos (se necessário), com água deionizada.

Para a reação colorimétrica, em um tubo de ensaio foram adicionados os 3,0 mL da amostra (sobrenadante), seguidos de 0,2 mL de reagente Folin. O sistema foi homogeneizado por meio de vórtice e mantido em repouso por um período de 5 min. Após este tempo, foi adicionada à mistura, 0,8 mL de solução de (Na)2CO3 150,0 g/L, seguido de agitação (em vórtice). O sistema foi então

deixado em repouso à temperatura ambiente, na ausência de luz e por um período de 30 min. Fez-se então a leitura em espectrofotômetro a 760 nm. Para

composição do branco, água deionizada foi adicionada em substituição à amostra. Seguiu-se o mesmo procedimento.