DE GLICOSE ATRAVÉS DE RT-PCR SEMIQUANTITATIVO
A fim de investigar a distribuição dos transcritos das enzimas supostamente marcadoras e do transportador de açúcar, fêmeas do inseto D. peruvianus foram dissecadas separando-se as regiões: intestino médio, corpo gorduroso, glândula salivar, túbulo de Malpighi, ventrículo 1, ventrículo 2 e ventrículo 3 do intestino médio. Após extração do RNA total destes tecidos (Figura 23), foi realizada a etapa de transcrição reversa partir de amostras de RNA total previamente tratadas com DNase I, utilizando-se o iniciador oligo (dT)12-18 na síntese da primeira fita. Em seguida, foi realizada a reação em cadeia da polimerase utilizando oligonucleotídeos
específicos para cada seqüência de interesse selecionada. O resultado foi analisado através da observação de bandas de DNA amplificadas pelo PCR em eletroforese em gel de agarose. Só nos interessa respostas sim e não, isto é, se determinada seqüência é expressa ou não em determinado tecido.
α-Glicosidase 1 é transcrita em corpo gorduroso e intestino, enquanto que a
α-glicosidase 2 foi encontrada apenas no intestino médio, mais especificamente no ventrículo 1 (Figura 24 C e D). Como corpo gorduroso não tem membrana perimicrovilar, a α-glicosidase 2 é que deve ser a marcadora dessa membrana. A ausência de transcrição de α-glicosidase em V2 e V3 contrasta com o fato de que as membranas perimicrovilares nessas regiões são mais desenvolvidas que em V1 (Silva e Terra, 1994; 1995; Silva et al., 1995; 1996). Assim, a baixa atividade de α- glicosidase associada com as MPM em V2 e V3 (Silva e Terra, 1994; 1995; Silva et al., 1995; 1996) deve corresponder a outra enzima ou à mesma enzima que é muito pouco transcrita.
A seqüência de β-glicosidase foi encontrada nos três ventrículos do intestino médio e nos túbulos de Malpighi (Figura 24 B). Como esta enzima está ligada nas microvilosidades do intestino médio (Silva et al., 1994), este resultado mostra o que já era esperado e sugere que as microvilosidades do túbulo de Malpighi sejam pelo menos em parte similares às intestinais. Através de estudos morfológicos em túbulos de Malpighi de Drosophila melanogaster foi observado membrana microvilar na região apical nos dois tipos celulares encontrados neste tecido (Wessing e Eichelberg, 1978; Dow e Davis, 2001). Além disso, a comparação desta seqüência similar a β-glicosidase com as depositadas no banco de dados do Swissprot demonstra que se trata de uma provável glicosilceramidase (Tabela 9). Já foi descrito que glicosilceramidases hidrolisam bem o substrato sintético NPβGlu e não têm atividade sobre celobiose (Ferreira et al., 1998). Para confirmar esta hipótese, foi dosada atividade frente estes dois substratos no homogeneizado do intestino médio de D. peruvianus, onde foi verificado hidrólise de NPβGlu e ausência de hidrólise de celobiose (dado não mostrado). Isto confirma a hipótese da presença de uma glicosilceramidase no intestino médio de D. peruvianus.
A aminopeptidase foi encontrada em todos os tecidos estudados, menos na glândula salivar (Figura 24 A), o que não confirma, mas também não descarta a possibilidade de ser o marcador procurado.
Quatro seqüências de catepsinas L foram estudadas e denominadas, DpCaL 1, 2, 3 e 4. A DpCaL 1 foi encontrada apenas no intestino médio, mais especificamente no ventrículo 2; DpCaL 2 foi encontrada em todos os tecidos menos na glândula salivar e no ventrículo 2 e 3, DpCaL 3 nos três ventrículos do intestino médio e DpCaL 4 nos ventrículos 2 e 3 do intestino médio e túbulos de Malpighi. De acordo com o padrão de expressão das catepsinas L transcritas nos diferentes tecidos, uma forte candidata a proteinase digestiva majoritária seria a DpCaL 1, já que esta encontra-se somente no ventrículo 2 do intestino médio, local com maior atividade específica de cisteína proteinase dentre os três ventrículos, determinada através ensaios enzimáticos com o substrato Z-FR-MCA e quantificação de proteínas (14.500 U/mg de proteína). A DpCaL 2 apesar de não ser expressa em V2 e V3 parece ser lisossômica, já que está visível nos demais tecidos. A DpCaL 3 pode ser uma segunda cisteína proteinase digestiva, sendo minoritária. A DpCaL 4 deve ser lisossômica pois está presente em túbulo de Malpighi apesar de não estar sendo expressa em corpo gorduroso.
O transportador de glicose, provavelmente do tipo GLUT (Tabela 8) foi observado apenas no intestino médio, estando predominantemente no ventrículo 1 e ventrículo 2 (Figura 24 I). Como já evidenciado por Silva e Terra (1994), V1 seria o principal sítio de absorção de água e glicose. Provavelmente V2 pode ter uma pequena participação em absorver a glicose remanescente que não foi completamente absorvida em V1. O tipo de experimento realizado por Silva e Terra (1994), assim como o descrito abaixo, não permitem confirmar ou descartar essa possibilidade de envolvimento de V2. O sítio de transcrição desse transportador é compatível com o seu envolvimento na absorção de glicose em V1.
FIGURA 23 - Eletroforese em gel de agarose 1,5% do RNA total extraído dos diferentes órgãos de D. Peruvianus.
TM, túbulos de Malpighi; GS, glândula salivar; CG, corpo gorduroso; IM, intestino médio; V1, ventrículo 1; V2, ventrículo 2; V3, ventrículo 3. Foi aplicado o volume de 10 µl de amostra, TM, GS, CG e IM cada um contendo 400 ng de RNA; V1, V2 e V3 cada um contendo 500 ng de RNA. O gel foi submetido ao tratamento por brometo de etídio e a banda de RNA total visualizada em transiluminador de UV 312 nm.
FIGURA 24 - Transcrição dos mRNAs correspondentes a proteínas escolhidas (Tabela 9) em vários tecidos de D. peruvianus mostrada através de RT-PCR semiquantitativo.
Quantidades iguais (5 µg) de RNA total dos diferentes tecidos foram extraídos, tratados com DNAse e utilizados como molde para a reação RT. O produto desta reação foi usado para amplificação em termociclador, utilizando oligonucleotídeos específicos para cada seqüência de cDNA e para o RNA ribossomal. O produto da amplificação foi analisado em gel de agarose 2% em TAE. As bandas amplificadas aparecem no tecido quando o
Aminopeptidase TM GS CG IM V1 V2 V3 β-glicosidase α-glicosidase 1 DpCaL 1 α-glicosidase 2 DpCaL 2 DpCaL 3 DpCaL 4 rRNA1 Transportador de açúcar rRNA2 A B C D E F G H J I L
mRNA correspondente é transcrito. TM, túbulos de Malpighi; GS, glândula salivar; CG, corpo gorduroso; IM, intestino médio; V1, ventrículo 1do intestino médio; V2, ventrículo 2; V3, ventrículo 3; rRNA, RNA ribossomal. O número de ciclos de amplificação foi escolhido, após diversas tentativas, para assegurar que a amplificação estivesse na fase log e resultando numa banda amplificada clara e visível em gel.
IDENTIFICAÇÃO DE TRANSPORTADORES ENVOLVIDOS NA ABSORÇÃO DE GLICOSE E ÁGUA NA