Das 147 amostras de carne “in natura” adquiridas em 24 estabelecimentos comerciais, 32 amostras eram referentes à carne bovina moída, 30 carne bovina peça (Semimembranosus), 35 de carne suína (Longuisimus dorsi) e 50 de carne de frango (Peitoralis profundus e superficialis).
Do total de amostras analisadas, 11,5% (17/147) apresentaram contaminação por Clostridium difficile. A distribuição de amostras de carnes positivas,considerando os dois tratamentos, para o micro-organismo C. difficile é apresentada na Tabela 9.
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Tabela 9. Ocorrência de C. difficile em amostras comerciais de carne bovina moída, carne de frango, carne bovina, carne suína.
Tipo de alimento Amostras positivas
Carne bovina moída 21,8% (7/32)
Carne de frango 18,0% (9/50)
Carne bovina peça 3,3% (1/30)
Carne suína 0,0% (0/35)
Total 11, 5% (17/147)
Dentre as amostras de carne moída bovina, 21,8% (7/32) foram positivas para C. difficile. Em relação aos tratamentos utilizados, 6 (85,7%) amostras foram positivas utilizando apenas o plaqueamento direto, e em apenas 1 (14,3%) amostra foi detectado C. difficile utilizando ambos os tratamentos, direto e com álcool. C. difficile foi detectado em 6 (85,7%) das amostras utilizando-se o meio CDMNA e em apenas 1 (14,3%) amostra o micro-organismo foi isolado utilizando-se ambos os meios seletivos.
C. difficile foi isolado em 18,0% (9/50) das amostras de carne de frango. Em
relação aos tratamentos utilizados, C. difficile foi detectado em 6 (66,7%) amostras utilizando apenas plaqueamento direto, em 2 (22,2%) amostras utilizando ambos os tratamentos (direto e com álcool) e 1 (11,1%) amostra com tratamento com álcool. Em relação aos meios seletivos CDMNA e CCFA, observa-se que em 6 (66,7%) amostras,
C. difficile foi isolado no meio CDMNA, em 3 (33,3%) amostras em ambos os meios
seletivos (CDMNA e CCFA).
No presente estudo, o micro-organismo foi isolado em apenas 1 amostra de carne bovina peça, ou seja, em 3,3% (1/30), C. difficile foi detectado pelo tratamento com álcool em ambos os meios seletivos (CDMN e CCFA).
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C. difficile não foi encontrado em amostras de carne suína, entretanto,
Weese et al. (2009) detectaram a presença de C. difficile em 12% (14/115) das amostras de carne suína analisadas.
Na Figura 4, apresentam-se a distribuição das amostras positivas para C.
difficile em amostras de carnes em função do procedimento utilizado (tratamento com
álcool e plaqueamento direto).
Figura 4. Número de amostras positivas com C. difficile em carnes comerciais de acordo com os procedimentos utilizados, plaqueamento direto e tratamento com álcool.
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Na Figura 5, apresentam-se a distribuição das amostras positivas para C.
difficile em amostras de carnes em função do meio seletivo utilizado (CDMNA e CCFA).
Figura 5. Distribuição de amostras positivas com C. difficile em carnes comerciais de acordo com os meios seletivos utilizados, CDMNA (ágar Clostridium difficile moxatactam norfloxacina) e CCFA (ágar cicloserina cefoxitina frutose).
Pelo fato das 85,7% e 66,7% das amostras serem positivas para C. difficile utilizando o plaqueamento direto em amostras de carne bovina moída e frango, respectivamente (Figura 4), significa que o micro-organismo apresentava-se na forma não esporulada após o enriquecimento em caldo CDMN, pois o tratamento com álcool tem por objetivo eliminar as células vegetativas presentes.
Em relação aos meios de isolamento (CDMNA e CCFA), observa-se que em 85,7% e 66,7% dos isolados de carne bovina moída e carne de frango, respectivamente foram positivos para o meio CDMNA (Figura 5).
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Clostridium difficile é um patógeno adquirido em hospitais, causador de
infecções intestinais, ocorrendo frequentemente em pacientes com tratamento intensivo com antibióticos, causando casos graves de colite pseudomembranosa. O micro- organismo já foi isolado em animais domésticos (RODRIGUEZ-PALACIOS et al., 2006). Em estudos realizados em animais vivos destinados a alimentação humana, onde avaliaram a presença de C. difficile em aves de granja, detectou a presença em 62% das fezes de aves, observando uma grande variação de acordo com a idade do animal (ZIDARIC et al., 2008). Em um estudo similar Simango e Mwakurudza (2008) isolaram de amostras de solo, fezes e de frangos vivos vendidos em mercados do Zimbabuwe.
As fontes de contaminação de C. difficile em alimentos ainda não é muito clara, entretanto há pesquisas onde encontraram ribotipos idênticos em isolados de C.
difficile provenientes de animais e do homem, sugerindo a potencial transmissão de C. difficile de animais para o alimento (ARROYO et al., 2005).
Clostridium difficile já foi isolado de animais destinados a alimentos, como
porcos, bovinos e aves (RODRIGUES-PALACIOS et al., 2006; SIMANGO, 2006; KEEL et al., 2007; HAMMITT et al., 2008; PIRS et al., 2008; SIMANGO e MWAKURUDZA, 2008; ZIDARIC et al., 2008). Desta forma gerando uma grande preocupação pois, durante o abate e processamento podem chegar ao alimento, tornando uma fonte de infecção.
Em estudo similar ao desenvolvido aqui, Wesse et al. (2010) avaliaram a presença de C. difficile em diversas amostras de carne de frango e detectaram a presença em aproximadamente 13% das amostras. Nesse estudo utilizou-se o tratamento com álcool, para eliminação de possíveis concorrentes vegetativos e posteriormente inoculou-se em ágar CDMN.
Rodriguez-Palacios et al. (2007) isolaram C. difficile em 20,8% (11/53) de amostras de carne moída, o micro-organismo foi isolado seguindo os seguintes procedimentos semelhantes aos utilizados no presente trabalho; as amostras foram enriquecidas em caldo CDMN suplementado com taurocolato de sódio, após incubados
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a 37°C por 10-15 dias. Realizou-se o tratamento com álcool e foram inoculados em meio CDMNA suplementado com sangue equino.
Em outro estudo Rodriguez-Palacios et al. (2009) detectaram C. difficile em 6,7% (10/149) das amostras de carne bovina moída e 4,6% (3/65) de costeletas de vitela. Em estudo mais recente, Jobstl et al. (2010) avaliou a presença de C. difficile em 100 amostras de carne bovina moída, onde 3% das amostras foram positivas.
Wesse et al. (2009) avaliaram 230 amostras de carne bovina e suína, do total de amostras avaliadas, 12% (28/230) foram positivas para C. difficile. Sendo 14 isolados provenientes de carne bovina e 14 isolados provenientes de carne suína.
Songer et al. (2009) verificaram a presença de C. difficile em alimentos in
natura e processados, dentre eles, carne moída (bovina, suína e peru) e salsichas,
coletadas em supermercados em Tucson, Arizona. Do total de 88 amostras, 37 (42%) foram positivas para o micro-organismo, sem significativa diferença na prevalência entre as amostras.
Outro estudo realizado com carnes in natura, Boer et al. (2011) analisaram 500 amostras (cordeiro, suíno, bovino, vitelo e frango) e apenas 8 apresentaram cultura positiva para C. difficile.
De modo geral, observando os resultados apresentados na Tabela 10, verifica-se que em apenas 3 amostras foram positivas nos dois procedimentos (plaqueamento direto e tratamento com álcool) e em ambos meios seletivos (CDMNA e CCFA).
O plaqueamento direto foi melhor (13/17), quando comparado a amostras recuperadas apenas no tratamento com álcool (1/17), porém o uso de ambos os procedimentos aumentou o número de amostras positivas (17/17).
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Tabela 10. Ocorrência de C. difficile em carne bovina moída, carne bovina peça, frango e suína, de acordo com os procedimentos (plaqueamento direto e tratamento com álcool) e meios seletivos (CDMNA e CCFA) utilizados.
Número de amostras
Tratamentos
Plaqueamento direto Tratamento com álcool
CCFA CDMN CCFA CDMN Frango n= 9 06 x 02 x x x x 01 x Bovina moída n= 7 06 x 01 x x x x Bovina peça n= 1 01 x x
Não foi encontrado C. difficile em amostras de carne suína. n= número de amostras
O baixo número de amostras positivas pode ser devido a reduzida seletividade do meio, bem como dos procedimentos e distribuição não homogênea ou ainda ao baixo número de esporos/células vegetativas. A presença de C. difficile em alimentos de origem animal in natura é causada principalmente por contaminação cruzada durante o abate e manipulação da carcaça.
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5.3 Avaliação do perfil toxigênico dos isolados de C. difficile
Avaliou-se o perfil toxigênico dos 80 isolados de C. difficile, provenientes de 17 amostras de carnes (Figura 6). Verificou-se que as cepas apresentavam o gene tcdA (codificador da toxina A) e tcdB (codificador da toxina B). O perfil da eletroforese dos fragmentos dos genes obtidos por PCR das cepas utilizadas como controle positivo é apresentado na Figura 7.
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Figura 7. Produtos de amplificação dos genes tpi (230 bp), tcdA (252 bp) e tcdB (204 bp) nas cepas de referência de C. difficile através da técnica da PCR.
Nota: Coluna M, marcador de peso molecular (100pb DNA ladder).
Observa-se na Tabela 11 que a distribuição dos determinantes genotípicos de virulência deste estudo revela que em 6,25% (5/80) dos isolados apresentam resultado positivo para pelo menos um gene de virulência avaliado (A-B+), e com ambos determinantes genotípicos de virulência (A+B+) observadas em 35,0% (28/80) desses isolados, ou seja, 58,75% (47/80) não apresentaram genes tcdA e tcdB (A-B-).
Os 33,75% (27/80) dos isolados oriundos das amostras de carne bovina moída não apresentaram perfil toxigênico (A-B-) e os provenientes das amostras de frango (peito de frango) apresentaram 3 perfis diferentes, 28,75% (23/80) A+B+, 6,25% (5/80) A-B+, 25,0% (20/80) A-B-. Todos os isolados provenientes da carne bovina peça (coxão mole) apresentaram perfil A+B+. Nenhum isolado apresentou o perfil A+B- (0/80).
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Tabela 11. Presença dos genes responsáveis pela produção da toxina A (tcdA) e B (tcdB) nos isolados de C. difficile obtidos em amostras de carnes.
Amostras
Números de isolados de C. difficile (%)
A+B+ A-B+ A+B- A-B- Total
Carne bovina
moída 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 27 (33,75%) 27 (33,75%) Peito de frango 23 (28,75%) 5 (6,25%) 0 (0,0%) 20 (25,0%) 48 (60,0%) Carne bovina peça 5 (6,25%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 0 (0,0%) 5 (6,25%)
Total 28 (35,0%) 5 (6,25%) 0 (0,0%) 47 (58,75%) 80 (100,0%) Positivo (+) = Presença
Negativo (-) = Ausência
Segundo os resultados apresentados na tabela 11, 58,75% (47/80) dos isolados de C. difficile avaliados pela técnica da PCR não apresentaram os genes tcdA e tcdB não foram consideradas toxigênicas pelo perfil genético com relação a presença dos genes tcdA e tcdB.
Do total de isolados, 44 cepas foram avaliadas quanto a expressão gênica (perfil fenotípico) através do teste RIDASCREEN C. difficile A/B (não diferencia as toxinas presentes). Observou-se que não houve expressão gênica em 22,7% (10/44) dos isolados (Tabela 12), onde o isolado apresentou os genes tcdA e tcdB, porém, não houve a expressão das toxinas, podemos afirmar que mesmo sem a detecção da toxina, a cepa não poderia ser considerada não toxigênica, pois as condições de crescimento poderiam estar desfavorecendo a expressão gênica.
A presença de gene codificador das toxinas e expressão gênica foi detectado em 9,1% (4/44) dos isolados de C. difficile (Tabela 12). Apenas 1 isolado
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predominou somente a presença do gene tcdB e consequentemente houve a expressão através da produção de sua respectiva toxina detectado através do teste fenotípico.
Comparando os resultados dos testes fenotípicos e genotípicos (Tabela 12), quanto a produção de toxinas pelos isolados de C. difficile, obteve-se uma concordância de 70,5% (31/44) entre os resultados, pois 61,4% (27/44) dos isolados apresentou resultados negativos tanto para produção de toxinas como para detecção dos seus genes codificadores e 9,1% (4/44) dos isolados apresentaram presença de gene codificador e expressão gênica.
Em 29,5% (13/44) das amostras houve discordância entre os testes, pois 6,8% (3/44) dos isolados não apresentaram genes referentes a produção de toxina A e B, mas houve a expressão gênica. Em 22,7% (10/44) dos isolados, apresentaram os genes tcdA e tcdB, porém não houve expressão gênica das toxinas.
Tabela 12. Comparação dos dados de detecção das toxinas A e B pelo teste RIDASCREEN toxina A/B e presença de gene codificadores de toxinas através da PCR de isolados de Clostridium difficile de amostras de carnes.
Número de Isolados (%)
Kit Ridascreen Toxina A/B
Total Positivo Negativo PCR Positivo 4 (9,1%) 10 (22,7%) 14 (31,8%) Negativo 3 (6,8%) 27 (61,4%) 30 (68,2%) Total 7 (15,9%) 37 (84,1%) 44 (100,0%)
O gene tcdA e tcdB encontram-se em um locus de patogenecidade denominado Paloc, ele é constituído por 5 genes : tcdA, tcdB, tcdC, tcdR e tcdE. Os genes tcdA e tcdB são responsáveis pela codificação das toxinas A e B, respectivamente. Acredita-se que os outros três genes são responsáveis pela regulação
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da produção das toxinas. O tcdR atua como um regulador positivo. O tcdC é altamente expresso durante a fase exponencial de crescimento da bactéria, diminuindo porém ao passo que o crescimento aproxima-se da fase estacionária. Esse declínio da expressão do tcdC é acompanhado de um incremento na produção das toxinas A e B, o que sugere que este gene atue como um regulador negativo. Por último, especula-se que o
tdcE facilite a liberação das toxinas A e B através da permeabilização da parede celular.
Com isso, pesquisadores acreditam que a expressão das toxinas de C. difficile é regulada positivamente pela expressão do tcdR, dependente da queda na expressão do
tcdC e a liberação das toxinas é mediada pela expresão do tcdE (VOTH e BALLARD,
2005).
Bouvet et al. (2008) observaram que cepas que apresentam exclusões do gene tcdC, consequentemente apresentavam um aumento na produção de toxinas A e B, ou seja, a expressão da toxina A e B só aumenta na medida do declínio da expressão do tcdC, desta forma atuando como regulador negativo.
Em 10 isolados do trabalho exposto, observa-se a presença de gene tcdA e tcdB, mas não houve a expressão gênica, desta forma, não podemos afirmar que estes isolados são toxigênicos, e como não foi realizado outro teste imunológico confirmatório, apenas a presença dos genes, não chegou a uma conclusão definitiva quanto ao seu perfil toxigênico. De acordo com Vernozy-Rozand et al. (1996) para provar a toxicidade seria necessário uma confirmação da produção de toxinas através de pelo menos 2 métodos e a identificação das respectivas toxinas.
É importante salientar que o teste da PCR com primers específicos para as toxinas pode ser utilizado para identificar bactérias portadoras de copias desses genes, todavia, não podem ser utilizados para determinar se os genes estão codificando proteínas, ou seja, suas toxinas.
Em 3 isolados, foi detectado as toxinas através do teste fenotípico RIDASCREEN, porém não houve a detecção dos genes. Este fato pode ser justificado por alguns pesquisadores que afirmam que poderia haver variações nas sequencias dos genes analisados onde dificultaria a correta ligação dos primers para a reação da
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PCR, assim como no caso de toxina estafilocócica, onde poderia haver uma possível toxina ainda não descrita que possui reação imunológica semelhante às das toxinas A e B (MCLAUCHLIN et al. 2000; JORGENSEN et al. 2005).
Desta forma analisar sequências de DNA poderia ser uma solução para revelar as possíveis diferenças nos genes dos isolados do presente estudo.
Outro fator determinante seria o número de isolados analisados, este fato poderia explicar a ausência de resultados positivos na detecção de genes codificadores (BECKER et al., 2001). No presente estudo foram avaliados apenas 80 isolados, e poderia ter sido um fator limitante na detecção dos genes codificadores, bem como da sua expressão, para uma maior precisão dos resultados, além dos primers utilizados, seria necessário um número mais elevado de isolados de C. difficile.
Em pesquisa realizada por Rodriguez-Palacios et al. (2009), os pesquisadores detectaram C. difficile em 6,7% (10/149) das amostras de carne bovina moída e 4,6% (3/65) de costeletas de vitela. Do total de isolados, 77% (10/13) apresentaram perfil toxigênico. Em estudo mais recente, Jobstl et al. (2010) avaliou a presença de C. difficile em 100 amostras de carne bovina moída, onde 3% das amostras foram positivas, dentre elas apenas 1 amostra obteve perfil toxigênico.
Wesse et al. (2009) avaliaram 230 amostras de carne bovina e suína. Do total de amostras avaliadas, 12% (28/230) das amostras foram positivas para C. difficile. Todos os isolados eram TcdA+/TcdB+.
Em estudo mais recente, Boer et al. ( 2011) avaliaram o perfil toxigênico dos isolados provenientes de 1,6% (8/500) de amostras positivas para C. difficile, do total de isolados, 62,5% (5/8) apresentaram perfil toxigênico TcdA+/TcdB+, e 37,5% (3/8) não foram toxigênicos.
55 6 CONCLUSÃO
No isolamento do micro-organismo, o plaqueamento direto apresentou maior eficácia em relação ao tratamento com álcool e o meio CDMNA apresentou maior número de recuperação comparada ao meio CCFA em amostras de carne bovina moída. Porém, o uso simultâneo de ambos os procedimentos e meios de cultura aumentou o número de recuperação de C. difficile.
O micro-organismo foi isolado de carne bovina moída, carne de frango (Peitoralis profundus e superficialis) e carne bovina peça (Semimembranosus).
O perfil de virulência foi positivo para pelo menos um gene de virulência (A- B+/A+B+) em 41,2% dos isolados de C. difficile.
Houve concordância de 70,5% entre os testes fenotípicos e genotípicos utilizados para detecção de toxinas.
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