SCOMT MBCOMT
E. coli Scale-up, baixo
3. M ATERIAL E M ÉTODOS
4.2. E STRATÉGIAS DE DOIS SAIS E BAIXA
4.2.4. C OMPARAÇÃO ENTRE ESTRATÉGIAS HIC
Verificou-se que, com a utilização de sistemas de dois sais optimizados, ambos os suportes permitiam a ligação e a eluição completa de hSCOMT num único pico cromatográfico. No entanto, a resina octil-sepharose requereu menores concentrações de sal (25 mM SA e CS) que a butil-sepharose (300 mM SA e 200 mM CS) para promover a ligação completa da enzima ao suporte. De facto, o aumento da cadeia n-alquil dos ligandos da fase estacionária leva ao aumento na hidrofobicidade e na força das interacções, permitindo assim o uso de menor força iónica para promover essas mesmas interacções. Embora o suporte butil apresente uma selectividade mais elevada e permita uma maior eliminação de proteínas contaminantes, foram necessárias maiores concentrações de SA e CS, que poderiam provocar uma inactivação parcial de hSCOMT e, consequentemente, resultar em menores níveis de actividade (tabela 8). Por outro lado, a temperatura de 5ºC aplicada ao longo de todo o passo cromatográfico levou à diminuição dos níveis de recuperação da enzima.
Já no suporte octil, a diminuição de temperatura apenas no passo de eluição permitiu obter uma recuperação substancial
82 Resultados e Discussão
de hSCOMT, além de reduzir a formação de agregados da enzima, contribuindo assim para a obtenção de elevados níveis de actividade enzimática (tabela 8).
Tabela 8 - Comparação entre a melhor estratégia de cada matriz, em termos de actividade específica e factor de purificação.
Suporte Estratégia HIC
Actividade Específica (nmol/h/mg proteína) Factor Purificação (fold)
Butil (0.3M SA/0.2M CS – 0.1M SA/0.1M CS – Tris) 5°C 596.6 1.1
Octil 0.025M SA/0.025M CS (T amb.) – Tris
(5°C) 1668 5.9
Foi adicionalmente alcançado um grau de pureza muito elevado neste suporte, apenas comparável com o grau de pureza obtido em estudos anteriores após dois passos cromatográficos, HIC em suporte butil-sepharose e cromatografia de filtração em gel. Além disso, foi conseguida uma redução dos níveis de SA na fase móvel em 96% relativamente às concentrações usadas em estudos anteriores, de 0.6M para 0.025M (tabela 9).
83
Resultados e Discussão
Portanto, a estratégia HIC recorrendo a um sistema de dois sais com concentrações basais de SA e CS e temperatura de 5ºC no passo de eluição aplicado num suporte octil permitiu a eliminação de um número elevado de contaminantes, auxiliou a eluição de hSCOMT monomérica num único pico cromatográfico e reduziu a degradação de hSCOMT provocada por maiores quantidades de SA. Portanto, este processo de purificação apresenta uma melhoria relativamente a estratégias anteriores HIC em termos de níveis de actividade específica e grau de pureza (tabela 9).
Tabela 9 – Comparação entre estratégias HIC para processos de isolamento de COMT em termos de conteúdo total de proteína, valores de actividade específica e factor de purificação.
Suporte Estratégia HIC
Proteína (mg) Actividade Específica (nmol/h/mg) Factor Purificação (fold) Butyl 0.6M SA – 0.2M SA – 0M SA (temp. amb.) 5 1688 1.8
Octyl 0.6M SA – 0M AS (temp. amb.) 13 677 1.5
Octyl 0.025M SA/ CS –
84 Resultados e Discussão
Perante os resultados obtidos na matriz octil, foi estudada a integração desta estratégia num processo global de purificação de hSCOMT. Este processo deveria incluir em primeiro lugar a melhor estratégia desenvolvida no suporte octil, seguido da estratégia HIC em suporte butil: 0.6 M SA – 0.2 M SA – 0 M AS (Passarinha et al., 2008) (Figura 34).
Figura 34 - Esquema da integração do processo de purificação de hSCOMT.
Os resultados apresentados pela combinação destas duas estratégias não foram satisfatórios, dado que os níveis de actividade e o grau de pureza não ultrapassaram os níveis obtidos com a utilização apenas da estratégia aplicada na coluna Octil (tabela 10). Como são efectuados dois passos cromatográficos, era de esperar que as fracções de hSCOMT recolhidas a 0 M SA na coluna Butil apresentassem valores
Octil-Sepharose
25 mM SA/CS (5ºC) 0 mM SA/CS
Butil-Sepharose
0.6 M SA 0.2 M SA 0 M SA
85
Resultados e Discussão
superiores de actividade específica e uma maior pureza. Seriam, portanto, necessárias optimizações futuras de modo a contornar esta situação.
Tabela 10 – Comparação entre valores de actividade específica e factor de purificação após a estratégia Octil-Butil.
Passo Actividade Específica (nmol/h/mg proteína)
Factor de Purificação
Octil 1668 5.9
86 Conclusão
5.
C
ONCLUSÃO
A instabilidade apresentada pela hSCOMT torna necessário o desenvolvimento de estratégias de purificação simples e rápidos que respeitem a natureza lábil da enzima de modo a permitir a obtenção de hSCOMT altamente pura e activa. Este trabalho tinha como principal objectivo a implementação de um sistema de dois sais, com SA e CS, aliado a varições de temperatura no sistema cromtográfico, numa estratégia de isolamento de hSCOMT com recurso a HIC.
Os dois suportes hidrofóbicos estudados, octil- e butil- Sepharose, diferiam em termos de hidrofobicidade e, consequentemente, iriam necessitar de diferentes concentrações de sal para promover a adsorpção de hSCOMT na matriz. De facto, foi requerida uma maior força iónica no suporte butil (200 mM CS) que levou à inactivação parcial de hSCOMT e a níveis de actividade enzimática reduzida. Por outro lado, o uso de concentrações basais de SA e CS no suporte octil demonstrou ser uma estratégia eficiente e uma boa alternativa às estratégias com recurso apenas a SA, no que toca à eliminação de contaminantes e à redução de agregação. Com a incorporação de
87
Conclusão
CS nesta estratégia, os níveis de SA foram reduzidos em 96%, diminuindo a possível degradação provocada por elevadas quantidades deste sal. Outro factor bastante importante na HIC e estudado neste trabalho foi a temperatura. Especificamente, nestes ensaios verificou-se que a realização do passo de eluição à temperatura de 5ºC permitiu a melhoria dos resultados obtidos à temperatura ambiente.
Assim, a aplicação de sistemas de dois sais, combinados com a redução da temperatura do sistema cromatográfico, em suportes hidrofóbicos, permite controlar a selectividade da adsorpção de interferentes e auxiliar na estabilização de hSCOMT, resultando em níveis superiores de actividade e grau de pureza. A HIC exibe uma versatilidade que a torna numa técnica útil em processos de isolamento de hSCOMT recombinante a partir de extractos complexos de fermentação e com vantagens adicionais em relação à cromatografia de afinidade.
Para conseguir uma maior estabilização desta enzima termolábil, que se poderá traduzir em maiores níveis de actividade, no futuro deveriam ser realizados estudos do efeito de aditivos, nomeadamente estabilizadores proteicos.
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6.
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