5.1. C
ONSIDERAÇÕES FINAISA investigação sobre a presença de metais contaminantes no vinho, no que respeita aos níveis de ocorrência, evolução ao longo do processo tecnológico, fontes de contaminação e ao desenvolvimento de métodos de análise adequados ao seu doseamento, é de enorme relevância e interesse, particularmente no âmbito tecnológico e da segurança alimentar.
Numa primeira fase do presente trabalho foram desenvolvidos e validados métodos para a determinação analítica de metais contaminantes dos vinhos, com recurso às técnicas analíticas de ETAAS e ICP-MS, e uma metodologia inovadora de preparação de mostos por ultra-sons de alta intensidade e focalização. Os métodos de análise desenvolvidos foram posteriormente aplicados nas etapas seguintes do trabalho, nomeadamente no estudo da cedência ao vinho de metais contaminantes das bentonites.
As técnicas analíticas de ETAAS e de ICP-MS apresentam limites analíticos, selectividade e precisão bastante apropriados ao doseamento dos metais contaminantes dos vinhos. A possibilidade de dosear vários elementos em simultâneo torna a técnica de ICP-MS especialmente interessante. No capítulo 2 deste trabalho apresentou-se uma metodologia inovadora de preparação de mosto e também o desenvolvimento e validação de métodos de análise para determinação do teor de Al e de Cu por ETAAS, e de um vasto conjunto de elementos por ICP-MS.
O controlo analítico do Al no vinho não é realizado por rotina em laboratórios de controlo da qualidade, não obstante os efeitos importantes e diversificados na sua qualidade. Acresce que a presença exógena deste elemento no vinho é preponderante, estando actualmente identificadas numerosas fontes de contaminação. O método analítico desenvolvido para doseamento do Al no vinho por ETAAS (secção 2.1 do capítulo 2) apresenta elevada selectividade, precisão e exactidão, permitindo a quantificação em amostras que contenham mais de 80 µg/L, teor largamente excedido pela generalidade dos vinhos. Os limites analíticos, precisão e taxas de recuperação observados são similares aos valores indicados por outros autores (Almeida et al., 1992; Lopez et al., 1998). A elevada diluição da amostra (1:40), factor potencial de erro associado ao resultado analítico, minimiza os efeitos de matriz tornando desnecessária a adição de modificadores desta. Uma das principais dificuldades do método proposto consiste no controlo de potenciais fontes de contaminação durante o processo analítico, dada a presença importante deste elemento também no ambiente laboratorial. Contudo, a simplicidade da preparação da amostra e a dispensa de utilização de modificadores de matriz, contribuem para a redução do risco de contaminação.
Em consequência da sua participação em fenómenos de instabilidade físico-química, o Cu é um dos metais contaminantes do vinho com maior interesse enológico e cujo teor é alvo de controlo legal (OIV, 2005). A técnica analítica de FAAS apresenta sensibilidade insuficiente para a determinação analítica do teor de Cu da generalidade dos vinhos, tornando necessária a pré- concentração da amostra ou o recurso ao método das adições de padrão (Catarino et al., 2003). Na
secção 2.2 do capítulo 2 apresentou-se o estudo de diferentes metodologias para o doseamento do Cu em vinhos, por ETAAS, orientado para a obtenção da sensibilidade necessária e para a minimização do custo económico da análise.
Uma das desvantagens das determinações convencionais por ETAAS é o tempo necessário para produzir um resultado analítico. Numa tentativa de minimizar essa desvantagem, desenvolveram-se programas térmicos alternativos, um programa convencional e um programa sem a etapa de pirólise (rápido), com ou sem adição de modificadores de matriz, embora o programa convencional conduza a maior sensibilidade do método. Quando aplicado o programa convencional, a utilização de modificadores de matriz [Mg(NO3)2 e Pd(NO3)2] para estabilização
térmica do Cu resultou no aumento da sensibilidade (cerca de 20%). Contrariamente, quando aplicado o programa sem etapa de pirólise, a utilização de modificadores de matriz não afectou de modo significativo a sensibilidade. Este método apresenta assim como principais vantagens a dispensa da utilização de modificadores de matriz, maior rapidez no fornecimento de resultados analíticos e consequentemente menor custo económico. A sensibilidade analítica do método com aplicação do programa convencional constitui a sua vantagem comparativa.
O método com recurso ao programa térmico convencional (seleccionado para validação) apresenta características de selectividade, precisão e exactidão elevadas, de acordo com o nível de qualidade exigido aos resultados analíticos. Por último, o limite de detecção do método em amostras não diluídas, 5 µg/L, é perfeitamente adequado para fins de controlo legal permitindo igualmente o doseamento na generalidade dos vinhos, sendo ligeiramente inferior ao valor de 6 µg/L, referido por Almeida et al. (1994).
A técnica multielementar de ICP-MS constitui um excelente instrumento para a caracterização da composição mineral do vinho. Na secção 2.4 do capítulo 2 apresentou-se o desenvolvimento de um método quantitativo e de um método semi-quantitativo para a determinação de 26 metais contaminantes do vinho. Numa fase inicial as potenciais interferências espectrais causadas por iões poliatómicos com origem nos elementos Ca e Cl foram estudadas e estabelecidas correcções matemáticas sobre os isótopos 51V, 53Cr, 57Fe, 59Co, 60Ni, 75As e 107Ag. Os
limites de detecção de ambos os métodos são suficientemente baixos para permitir o controlo da qualidade do vinho, e 10 a 100 vezes inferiores aos limites de detecção encontrados por outros autores (Baxter et al., 1997; Pérez-Jordan et al., 1998; Almeida e Vasconcelos, 2002; Taylor et al., 2003; Gómez et al., 2004), utilizando equipamentos de ICP-MS com dispositivo para separação de massas semelhante (quadropolo). Os limites de detecção do método quantitativo para o Cu, Zn, As, Cd e Pb, elementos para os quais se encontram definidos limites máximos aceitáveis (OIV, 2005), são de 0,01; 0,02; 0,002; 0,001 e 0,001 µg/L, respectivamente. Para a maioria dos elementos o método semi-quantitativo apresenta limites de detecção similares ou ligeiramente superiores aos do método quantitativo, como seria de esperar.
O estudo das taxas de recuperação, conduzido para avaliação da exactidão do método, permitiu observar valores entre os 80 e 120% para todos os elementos, com excepção do Cr. As interferências poliatómicas que afectam o isótopo 53Cr, não foram eficazmente corrigidas pelo que
se considerou não ser possível quantificar o Cr pelo método proposto. As taxas de recuperação referidas são similares às taxas de recuperação encontradas por outros autores (Baxter et al., 1997; Pérez-Jordan et al., 1998) para vinhos de mesa, utilizando tratamento da amostra similar e com recurso a nebulizadores tipo crossflow. O método quantitativo e o método semi-quantitativo são comparáveis em termos de precisão. As diferenças entre os resultados analíticos obtidos por aplicação dos dois métodos são inferiores a 20% (erro do método semiquantitativo) para todos os elementos estudados, com excepção do Fe, Zn, Se, Cd, In, Tl e U (em vinho branco) e do Al, Fe, Se, Cd, In, Bi e U (emvinho tinto). A calibração realizada no método semi-quantitativo, utilizando uma concentração única para todos os elementos independentemente do seu nível de concentração no vinho, poderá em parte explicar as diferenças observadas para os elementos situados nos extremos da gama de trabalho, nomeadamente para o Se, Cd, In, Tl e U (extremo inferior), e para o Fe, Zn e Al (extremo superior).
De um modo geral, o método semi-quantitativo conduziu a resultados analíticos ligeiramente inferiores aos resultados analíticos fornecidos pelo método quantitativo, o que está de acordo com observações de Almeida e Vasconcelos (2002). Para alguns elementos, Fe, Cu, Zn, Cd e Pb, os resultados analíticos obtidos pelo método quantitativo foram validados por comparação com os resultados obtidos por AAS. Para fins de controlo legal do Zn e Cd, o método semi- quantitativo desenvolvido não é adequado, uma vez que não apresenta a exactidão necessária.
Finalmente, vinhos provisoriamente certificados foram analisados pelo método quantitativo, verificando-se a ocorrência de erro sistemático, com as concentrações obtidas sempre inferiores às concentrações certificadas, provavelmente explicado pela diminuição do conteúdo mineral do vinho por precipitação. Em conclusão, ambos os métodos representam alternativas valiosas com vista à caracterização mineral do vinho, nomeadamente para fins de comparação de amostras, sendo que o método semi-quantitativo fornece resultados analíticos mais rapidamente e com menor custo económico. Contudo, como instrumento para controlo legal o método quantitativo é sem dúvida o mais adequado.
O mosto contém uma quantidade elevada de matéria orgânica que se torna necessário eliminar de modo a evitar interferências na análise por ETAAS ou ICP-MS. Os métodos clássicos de digestão apresentam um risco importante de introdução de contaminação mineral inerente às manipulações da amostra e introdução de reagentes, não sendo por isso adequados para análise de metais vestigiais. Actualmente, a metodologia mais vulgarizada consiste na digestão por microondas, o que implica obviamente a utilização de equipamento apropriado, nem sempre disponível nos laboratórios de enologia. Por outro lado, os processos de oxidação avançada
possuem numerosas vantagens em relação à digestão por microondas (Capelo-Martinez et al., 2004).
Na secção 2.3 do capítulo 2 apresentou-se o desenvolvimento e validação de uma metodologia inovadora para extracção dos metais ligados à matéria orgânica do mosto, consistindo na aplicação de ultra-sons de alta intensidade e focalização, conjugados com HNO3 e H2O2. Após a
determinação do teor de Pb (elemento modelo) por ETAAS, em três laboratórios diferentes, os resultados do tratamento proposto foram comparados com os resultados obtidos por digestão por microondas, não tendo sido observadas diferenças estatisticamente significativas. No âmbito da análise do Pb por ETAAS foram desenvolvidos diferentes programas térmicos, convencional e sem etapa de pirólise, em associação com diferentes modificadores de matriz [Pd(NO3)2; KMnO4;
KMnO4 + HCl; Pd(NO3)2]. A determinação do Pb no mosto por ETAAS, sem etapa de pirólise,
revelou-se possível na presença de Pd(NO3)2 como modificador de matriz. Por outro lado, o
programa térmico convencional, com ou sem modificador de matriz, permite o doseamento em amostras de mosto tratadas por ultra-sons na presença de HNO3 e de H2O2. Das vantagens desta
metodologia, comparativamente às metodologias clássicas e à digestão por microondas, salienta-se desde logo a necessidade de um volume de amostra e de reagentes reduzido e a rapidez do tratamento, para além do custo reduzido do equipamento de ultra-sons.
Um aspecto fulcral e comum às metodologias referidas anteriormente para a análise de elementos minoritários, vestigiais e sub-vestigiais no vinho consiste nos cuidados que obrigatoriamente devem ser colocados ao longo do processo analítico, de modo a minimizar a ocorrência de contaminações.
Em conclusão, os resultados constantes do capítulo 2 demonstram a disponibilidade de métodos de análise, com recurso às técnicas de ETAAS e ICP-MS, adequados ao doseamento de metais contaminantes nos vinhos, apresentando requisitos de qualidade que permitem depositar confiança nos seus resultados analíticos, e eventualmente aplicáveis para fins de controlo legal. Considerando a sua aplicabilidade em laboratórios de enologia e/ou de controlo, a técnica de ETAAS apresenta como principais vantagens comparativas o pequeno volume de amostra necessário, ausência de interferências espectrais e custo moderado. Por sua vez, a técnica de ICP- MSdestaca-se por permitir a análise multi-elementar, e elevada produtividade. Contudo, é afectada por importantes interferências espectrais e de matriz, sendo particularmente exigente ao nível de desenvolvimento de métodos, e apresenta custos bastante elevados relacionados com a aquisição de equipamento e com custos operacionais, o que explica a sua ainda escassa implantação nos laboratórios de enologia (actualmente única em Portugal).
A composição mineral do vinho é influenciada por factores ambientais, tais como fenómenos geológicos e atmosféricos, e por factores antrópicos. Com vista a estudar a evolução do
teor em metais contaminantes ao longo do processo tecnológico, avaliou-se a composição de sete vinhos (obtidos por microvinificação) e dos respectivos mostos de origem em Li, Be, Al, V, Mn, Fe, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, As, Se, Rb, Sr, Cd, In, Cs, Ba, Hg, Tl, Pb, Bi e U (capítulo 3). As amostras de mosto foram preparadas para análise por aplicação da metodologia com recurso a ultra-sons de alta intensidade e focalização para preparação de mostos para análise (secção 2.3 do capítulo 2). O conteúdo mineral de mostos e vinhos foi analisado pelo método quantitativo por ICP-MS (secção 2.4 do capítulo 2).
Os resultados comprovam uma importante capacidade natural de eliminação de metais contaminantes por parte dos mostos, sendo esta a principal conclusão a destacar. Para um importante conjunto de elementos, Be, Al, Mn, Co, Ni, Cu, Zn, Ga, Rb, Cd, Ba, Tl and U, observaram-se decréscimos importantes do mosto para o vinho, provavelmente devido a precipitações sob a forma de sulfuretos e a fenómenos de adsorção e absorção por leveduras e bactérias. Essas perdas, como seria de esperar, foram mais acentuadas nos vinhos com pH mais elevado. O decréscimo do teor de Cu foi particularmente relevante, representando em média cerca de 90% do teor inicial, atingindo cerca de 8 mg/L. Verificou-se nos vinhos tintos um enriquecimento em Li, Fe, Sr, In e Bi, provavelmente relacionado com a tecnologia de vinificação aplicada, concretamente com a maceração das partes sólidas. Em duas amostras verificou-se um aumento ligeiro do teor de Pb (15 µg/L, aproximadamente) do mosto para o vinho, evidenciando a ocorrência de contaminação de origem não identificada. Para as restantes amostras foram observadas reduções importantes no teor deste elemento, corroborando observações de outros autores (Teissèdre et al., 1993; Pellerin et al., 1997).
As concentrações dos elementos analisados são inferiores aos limites máximos estabelecidos e de um modo geral podem considerar-se reduzidas, especialmente quando confrontadas com a literatura (McKinnon et al., 1992; Sudraud et al., 1994; Eschnauer e Scollary, 1995; Greenough et al., 1997; Teissèdre et al., 1998a; Teissèdre et al., 1998b; Lima et al., 2004; Thiel et al., 2004). No entanto, na interpretação e discussão destes resultados deverá ser incluído o processo tecnológico aplicado na obtenção dos vinhos, nomeadamente a não utilização de auxiliares tecnológicos, à excepção de dióxido de enxofre. De facto, na produção de vinhos à escala industrial, e também à escala artesanal, são utilizados diversos produtos susceptíveis de introduzir contaminação mineral, sendo também maior o número de operações tecnológicas que implicam o contacto do vinho com materiais.
Do conjunto de auxiliares tecnológicos autorizados pela OIV, a bentonite é certamente um dos produtos de utilização mais generalizada na produção de vinho. A sua aplicação visa essencialmente a clarificação e estabilização proteica dos vinhos, representando contudo um risco bastante importante de contaminação mineral. O conhecimento dos fenómenos de extracção e cedência de elementos minerais para o meio, e dos factores com influência nesses fenómenos,
sendo fundamental para prevenir a ocorrência dessas contaminações, é ainda manifestamente insuficiente. Acresce que a oferta deste produto no mercado é bastante diversificada e a informação sobre a sua potencial cedência mineral para o vinho muito escassa.
A utilização de bentonites no âmbito da sua influência na composição mineral do vinho apresenta diferentes vertentes de estudo. No capítulo 5, numa fase inicial desta linha de trabalho, realizaram-se ensaios de extracção com vinho e soluções teste, utilizando bentonites adquiridas no mercado. A análise da composição mineral das bentonites e das soluções de extracção foi realizada por AAS e ICP-MS (métodos descritos no capítulo 2). O efeito de contaminação mineral provocado pela adição de bentonites ao vinho foi confirmado para um largo conjunto de elementos (Li, Be, Na, Mg, Al, Ca, Sc, V, Mn, Fe, Co, Ni, Ga, Ge, As, Sr, Y, Zr, Nb, Mo, Cd, Sn, Sb, Ba, W, Tl, Bi e W). Em oposição, e de acordo com observações de outros autores (Enkelmann, 1988; Jakubowski et al., 1999; Gómez et al., 2004; Nicolini et al., 2004), a adição de bentonite provocou um decréscimo nos níveis de B, K, Cu, Zn e Rb. Importa salientar que a dose de bentonite utilizada nos ensaios de extracção foi bastante superior às doses normalmente utilizadas na prática enológica, pelo que os resultados não podem ser directamente transpostos. Estes resultados devem ser considerados nos trabalhos que visam estabelecer uma relação directa entre a composição mineral de um vinho com a sua origem geográfica. Esta é ainda uma área de trabalho envolvida em alguma polémica (Jakubowski et al., 1999; Gómez et al., 2004; Thiel et al., 2004), à semelhança de outros trabalhos que visam a determinação da origem do vinho em função da presença e/ou conteúdo em determinada espécie química.
Verificaram-se diferenças significativas entre as bentonites no que respeita ao seu efeito sobre a composição mineral do vinho, revelando a importância das suas características físico- químicas nos fenómenos de extracção. À diversidade natural das bentonites acresce a diversidade natural da composição dos vinhos, o que torna ainda mais complexa a previsão do efeito de determinada bentonite.
Uma importante e inovadora vertente desta linha de trabalho consistiu no estudo da relação das características físico-químicas da bentonite com a cedência mineral ao vinho. Verificou-se a existência de uma correlação forte entre a cedência de Na ao vinho e a proporção deste elemento no complexo de troca de cada bentonite (r = 0,881, P = 95%). Foram ainda constatadas correlações importantes entre a cedência de Al e de Fe e o conteúdo das bentonites em compostos não cristalinos de Al e Fe (r = 0,784 e r = 0,808, respectivamente; P = 95%). Para o Be, Mg, Ca, V, Mn, Ni, Ge, Zr, Nb, Mo, Sn, Sb, Tl, Pb e U observaram-se boas correlações com os resultados da composição multi-elementar das bentonites.
Actualmente, a OIV estabelece um conjunto de especificações relativas a características físico-químicas que as bentonites deverão respeitar com vista à sua utilização enológica (Resolução OIV Oeno 11/2003). De salientar que algumas bentonites estudadas apresentaram características não conformes com essas especificações: o teor mínimo de montmorilonite estabelecido não foi
respeitado por nenhuma das bentonites; uma das bentonites apresentou um teor em Fe extraível superior ao limite máximo; o conteúdo em Na solúvel das bentonites naturais (não activadas) foi superior ao teor máximo estabelecido. O controlo da qualidade das bentonites não é realizado por rotina por nenhum laboratório nacional de controlo oficial, o que permite supor o desconhecimento sobre a qualidade dos produtos e a circulação de produtos não conformes.
Outra conclusão importante retirada deste trabalho foi que a percentagem de montmorilonite não é um indicador satisfatório da reactividade da bentonite, dado que as características da fracção argilosa revelaram ser mais importantes do que a sua quantidade. Um outro aspecto observado, com especial importância tecnológica, diz respeito ao efeito significativo do pH na cedência mineral, contrariando estudos realizados anteriormente (Nicolini et al., 2004). De um modo geral, foram observados maiores enriquecimentos ao nível de pH mais baixo. Esta informação deverá ser tida em conta de modo a minimizar o risco de contaminação ao longo do processo tecnológico.
No âmbito da OIV, para controlo da qualidade das bentonites no que respeita ao seu efeito potencial de contaminação mineral, é estabelecida a realização de ensaios de extracção com uma solução teste cuja composição consiste em uma solução de ácido tartárico a 5 g/L (Resolução OIV Oeno 11/2003).
A comparação entre o enriquecimento verificado pelo vinho e o enriquecimento verificado pela solução teste indicada pela OIV permitiu observar resultados muito diferentes, pelo que se conclui que a solução de ácido tartárico não é indicada para fins de controlo da qualidade das bentonites, uma vez que não simula o efeito de extracção do vinho. Verificou-se que em algumas amostras de bentonite os teores extraídos de Na, Al, Fe e As superaram os limites máximos estabelecidos (Resolução OIV Oeno 11/2003), o que, mais uma vez, permite colocar algumas questões sobre a qualidade destes produtos e o seu controlo oficial.
Constatada a inadequação da solução teste preconizada pela OIV, ensaiaram-se soluções de extracção com composições alternativas em paralelo com o vinho. A diversidade dos vinhos no que respeita à sua composição química (constituindo um forte obstáculo à sua padronização) é mais um factor com influência na cedência mineral, e que acresce à diversidade natural das bentonites. Elementos com acção directa nos fenómenos de troca catiónica (K, Mg, Na, Mg) e proteína (proteína extraída de vinho e BSA) foram incluídos nas soluções de extracção, de modo a simular a composição do vinho. A natureza da proteína mostrou ser um factor importante, provavelmente relacionado com o efeito do seu volume no processo de adsorção, o que está de acordo com conclusões de Achaerandio et al. (2001). De um modo geral a solução com proteína de vinho foi capaz de simular ligeiramente melhor o vinho do que a solução com BSA. Embora nenhuma das duas soluções tenha simulado o vinho de modo totalmente satisfatório foram retiradas indicações de grande utilidade para o prosseguimento desta linha de trabalho.