ORAC (Capacidade de absorver radicais livres)

O ensaio ORAC feito seguindo o procedimento descrito por Davalos et al. (2004), com algumas modificações. Este ensaio foi dividido em duas etapas, a partir da extração etanólica das folhas foi feito o ensaio ORAC hidrofílico, e a partir do extrato hexânico das folhas fez-se o ORAC lipofílico. A análise de ORAC foi realizada apenas com os extratos etanólico e hexânico das folhas de E. uniflora.

Os Reagentes utilizados foram:

AAPH: 2,2´-azobis (2-methylpropionamidine) dihydrochloride, 97% - Peso Molecular: 271,20. Fórmula molecular: [=NC(CH3)2C(=NH)NH2]2 x 2 HCl. Empresa: Aldrich, lote 11120JC-505, número do catálogo: 44,091-4. Validade: 02/2010.
Trolox: 6-Hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid – Aldrich. Peso

Molecular = 364,33.

FL: Fluoresceína Sódica. Fórmula molecular: C20H10Na2O5. Empresa: VETEC, Lote 0604815. Validade 08/2011.

Tampão Fosfato de Potássio pH 7.0, 0.075 M

O Fluorímetro utilizado foi um Novo Star, BMG Labtechnologies. Serial number 700-0054. Placa preta, 96 poços, marca Greiner 655096 uclear 96.

Após a adição de todos reagentes na placa, fez-se a leitura da fluorescência a cada 1 minuto, durante 80 minutos. Foram utilizados os seguintes filtros: emissão 520 nm e excitação 485 nm. A temperatura no equipamento era de 37 ºC. Todos os extratos foram preparados em duplicata e lidos em triplicata. Para cada placa lida, fez-se uma nova curva do padrão Trolox.

As leituras da fluorescência a cada minuto foram utilizadas no cálculo da AUC, que é a área abaixo da curva, formada no gráfico, onde x corresponde ao tempo e y ao decaimento da fluorescência. A fórmula utilizada para o cálculo da AUC foi a seguinte:

AUC = 1 + f2/f1 + f3/f1 + f4/f1 + fn/f1 [29]

Onde:

f1 = leitura da fluorescência no tempo 1 minuto f2 = leitura da fluorescência no tempo 2 minutos fn = leitura da fluorescência no tempo 80 minutos

Foi calculado o valor de AUC para todas as amostras, nas diferentes concentrações do Trolox e para o Branco. O valor do AUC do branco foi subtraído dos valores do AUC do padrão e das amostras. Fez-se um gráfico do padrão Trolox onde o eixo X refere-se ao AUC e o eixo Y à concentração (µM) do padrão na placa. Pela equação da reta, utilizou-se a AUC de cada amostra para que fosse encontrada a concentração de Trolox. O resultado final foi expresso em µM Trolox Equivalente/ g extrato. Para os demais padrões lidos, o resultado final foi expresso em µM Trolox Equivalente/ µM padrão, pois o mesmo foi preparado na concentração de 1 µM (concentração final).

Tampão Fosfato de Potássio: Para 1 L de Fosfato de Potássio Dibásico, com Peso Molecular de 174,18, pesou-se 13,06 g. Pesou-se 10,21 g de Fosfato de Potássio Monobásico, cujo peso molecular é 136,09, para o preparo de 1 L de solução. Adicionou-se o fosfato de potássio monobásico em um béquer contendo o fosfato de potássio dibásico, até pH 7,4. Este tampão foi armazenado em geladeira por 1 semana.

Fluoresceína: A concentração estoque de Fluoresceína foi de 3,87 mg/mL, esta solução foi dissolvida em Tampão e ficou armazenada por até 2 semanas na geladeira, envolvida com papel alumínio. Antes do ensaio, preparou-se a partir da solução estoque, uma segunda solução na concentração de 0,0387 mg/mL e fez- se uma última diluição até concentração de 0,000378 mg/mL. Para o ensaio, retirou-se desta terceira solução um volume de 120 µL de FL para cada poço na placa. Logo, a concentração final (placa) de Fluoresceína foi de 0,0002322 mg/mL.
AAPH: A concentração estoque do radical foi de 108 mg/mL, completando o volume com água. Desta solução, retirou-se 60 µL para cada poço na placa. Logo a concentração final (placa) de AAPH foi de 32,4 mg/mL. A solução de AAPH foi sempre preparada minutos antes de ser colocada na placa.

Trolox: Este análogo da vitamina E serviu como padrão para o ensaio ORAC. Ele foi utilizado nas concentrações finais de: 0,5; 1,0; 10; 25; 50; 80 e 100 µM. O Trolox mais concentrado (1000 µM) foi preparado em eppendorfs e mantido em biofreezer na temperatura de -80 ºC, as diluições foram feitas com Tampão Fosfato de Potássio, pH = 7.

Os reagentes previamente preparados foram adicionados na seguinte ordem dentro de cada poço na placa:

1º) 20 µL de Extrato, na concentração inicial de 6 mg/mL. Para o branco foram adicionados 20 µL Tampão e para o Padrão, 20 µL de Trolox.

2º) 120 µL de Fluoresceína 4º) 60 µL de AAPH

O preparo das soluções para a análise do ORAC lipofílico foi a seguinte:

Tampão Fosfato de Potássio: Para 1 L de Fosfato de Potássio Dibásico, com Peso Molecular de 174,18, pesou-se 13,06 g. Pesou-se 10,21 g de Fosfato de Potássio Monobásico, cujo peso molecular é 136,09, para o preparo de 1 L de solução. Adicionou-se o fosfato de potássio monobásico em um béquer contendo o fosfato de potássio dibásico, até pH 7,0. Este tampão foi armazenado em geladeira por 1 semana.

Fluoresceína: A concentração estoque de Fluoresceína foi de 3,87 mg/mL, esta solução foi dissolvida em Tampão e ficou armazenada por até 2 semanas na geladeira, envolvida com papel alumínio. Antes do ensaio, preparou-se a partir da solução estoque, uma segunda solução na concentração de 0,0387 mg/mL e fez- se uma última diluição até concentração de 0,000378 mg/mL. Para o ensaio, retirou-se desta terceira solução um volume de 120 µL de Fluoresceína para cada poço na placa. Logo, a concentração final (placa) de Fluoresceína é de 0,0001786 mg/mL.

AAPH: A concentração estoque do radical foi de 108 mg/mL, completando o volume com água. Desta solução, retirou-se 120 µL para cada poço na placa (dobro do volume adicionado de AAPH na reação hidrofílica). Logo a concentração final (placa) de AAPH foi de 49,85 mg/mL. A solução de AAPH foi sempre preparada minutos antes de ser colocada na placa.

Trolox: Foi utilizado nas concentrações finais de: 0,5; 1,0; 10; 25; 50; 80 e 100 µM. A concentração estoque do Trolox mais concentrado (1500 µM) foi preparada em eppendorfs e mantida em biofreezer na temperatura de –80 ºC, as diluições foram feitas com Tampão Fosfato de Potássio.

Methyl β-Ciclodextrina randomizada: A ciclodextrina foi preparada na concentração de 7 % em solução de Acetona:Água (1:1).

Os reagentes previamente preparados foram adicionados na seguinte ordem dentro de cada poço na placa.

1º) 20 µL de extrato, na concentração inicial de 1 mg/mL (ou 1g/L), dissolvido com etanol, ultrassonificado por 2 horas e filtrado com membrana de acetato celulose 0,22 µm. Para o branco foram adicionados 20 µL de Ciclodextrina no lugar do extrato e para o Padrão, 20 µL de Trolox.

3º) 120 µL de Fluoresceína 4º) 120 µL de AAPH

Logo, o ensaio ORAC hidrofílico teve como volume final 260 µL.

4.5 Modelagem termodinâmica