Organização das fibras de colágeno tipo I em gel tridimensional avaliada por

Com o objetivo de avaliar a organização das fibras de colágeno tipo I em gel tridimensional, analisamos géis compostos de colágeno tipo I normal (não glicado) e glicado in vitro em microscópio confocal multifoton utilizando a detecção de second

harmonic generation (SHG), que permite a observação de estruturas anisotrópicas como o

colágeno. Essas imagens podem ser empregadas para diferir simultaneamente as amostras quanto à organização estrutural das fibras nos diferentes géis. Podemos observar que as fibras de colágeno tipo I do gel de colágeno glicado (Figura 14 B), apresentam uma maior presença de grumos (setas), quando comparados com a imagem do colágeno não glicado (Figura 14 A), que apresenta uma organização mais homogênea. Sugere-se que este aspecto seja resultado do aumento de ligações cruzadas em amostras que sofreram glicação.

Figura 14- Imagem obtida por geração de segundo harmônica (SHG) por microscopia multifotônica em gel de colágeno normal (A) e colágeno glicado (B) Setas apontam regiões condensadas no colágeno glicado. Objetivo 63X. Barra= 20µm.

5.1.4 Colágeno tipo I glicado in vitro apresenta resistência à tração (tensão máxima e módulo de elasticidade) menor do que o colágeno controle

Com a finalidade de medir algumas propriedades mecânicas do colágeno tipo I normal e glicado, foi realizado ensaio de resistência à tração. Amostras de colágeno tipo I normal e glicado foram submetidas à liofilização e adquiriram características flexíveis, o que permitiu a realização do ensaio de resistência à tração. A observação macroscópica do colágeno glicado liofilizado mostrou diferenças na sua estrutura, com aparência menos uniforme no tamanho e na forma quando comparado com o colágeno normal (Figura 15). Posteriormente, as amostras foram tracionadas uniaxialmente até a sua ruptura. A velocidade de deslocamento da garra móvel foi de 5 mm/min.

Os resultados mostram que houve uma redução na resistência à ruptura da amostra de colágeno glicado, quando comparado com o colágeno normal (6,10 ± 0,69 vs. 1,02 ± 0,07 kPa, média ± EPM **p<0,0005) (Figura 16 A). Esses resultados mostram que o amostra de colágeno glicado possui uma menor capacidade de suportar a tração exercida uniaxialmente antes de romper-se. Evidências da literatura mostram que as alterações nas propriedades mecânicas causadas pela glicação em fibras de colágeno traduzem-se em aumento da rigidez, levando a um tecido mais quebradiço, comprometendo seu funcionamento adequado (LIAO et al., 2009).

Observamos também uma redução no módulo de elasticidade ou módulo de Young em colágeno glicado quando comparado com colágeno normal (72,46 ± 4,0 vs. 3,50 ± 1,46 kPa, média ± EPM **p<0,0005) (Figura 16 B). O módulo de elasticidade é uma grandeza proporcional à rigidez de um material quando este é submetido à tensão extrema de tração. É a razão entre a tensão aplicada e a deformação sofrida pelo corpo de prova. Observamos que o módulo de elasticidade do colágeno normal é muito maior do que o módulo de elasticidade do colágeno glicado. Assim, quanto menor o módulo, mais rígido é o material. É importante ressaltar que esta análise foi realizada em amostras liofilizadas, e não em colágeno reconstituído (gel).

Figura 15- Imagem dos corpos de prova para o ensaio de tração. Para o ensaio de tração as amostras foram cortadas no mesmo tamanho (3mm) para que a garra do equipamento tivesse o mesmo comprimento inicial para realizar as medidas.

Figura 16-Ensaio de resistência à tração. Colágeno normal e glicado foram submetidos à mesma velocidade de deslocamento da garra móvel (5mm/min). (A) Os resultados são expressos em kPa, pois mostram a tensão máxima que o corpo de prova suporta até sua ruptura total. Análise estatística utilizando test t de Student, com **p<0,005. (B) Os resultados de resistência à tração expressando o módulo de elasticidade, que é a razão entre a tensão exercida e a deformação sofrida pelo material. Também são expressos em KPa. Análise estatística utilizando test t de Student, com ***p<0,0005.

Te nsão máxima 0 2 4 6 8 Colágeno Norm al Colágeno Glicado ** T e n s ã o à r u p tu ra ( k P a ) M ódulo de e lasticidade 0 20 40 60 80 100 Colágeno Norm al Colágeno Glicado *** M ó d u lo d e e la s ti c id a d e ( k P a ) A B

5.2 Ensaios biológicos com colágeno tipo I normal e glicado em fibroblastos derivados de ratos controles (C) e diabéticos (D)

5.2.1 Crescimento celular sobre colágeno normal e glicado

Os fibroblastos utilizados nesta etapa do trabalho foram obtidos de ratos controle (C) e diabéticos (D), mantidos em condições de cultura em meio controle (glicose 5mM) para fibroblastos C ou com alta concentração de glicose (30 mM) para D.

A curva de crescimento foi realizada por 3 dias, com contagens a cada 24 horas. As células (1 x 103) foram, portanto, semeadas sobre 100 µg/ml de colágeno normal (CN) ou colágeno glicado (CG) por 24, 48 e 72 horas. Quando comparamos as células C e D sobre colágeno normal, não observamos diferenças significativas entre os grupos mesmo após 72 h (respectivamente 7467 ± 1920 vs. 4133 ± 1090, média ± EPM), embora haja uma tendência de redução da proliferação em D (Figura 17). Frente ao colágeno glicado as células D apresentaram uma redução de 46% no crescimento durante o ensaio, sendo esta diferença estatisticamente significativa após 72 horas (5400 ± 400 vs. 2900 ± 400, média ± EPM, * P<0,0001). É importante mencionar que o colágeno glicado não alterou a viabilidade celular, uma vez que a contagem de células na presença do corante vital Azul de Tripan não evidenciou morte celular.

Figura 17- Ensaio de curva de crescimento sobre colágeno normal (não glicado) e sobre colágeno glicado. As células derivadas de ratos controle e diabéticos foram semeadas sobre 100 µg/ml de colágeno por 24, 48 ou 72 horas. *p<0,0001, segundo Anova One way e pós- teste de Tukey.

5.2.2 Espraiamento celular e arranjo do citoesqueleto de actina sobre colágeno normal e glicado

As células C e D foram semeadas sobre lamínulas de vidro previamente cobertas com 100 µg/ml de colágeno normal ou glicado e incubadas por 1 hora. Após fixação e evidenciação de F-actina, avaliamos o espraiamento celular e o citoesqueleto de actina. As células C e D não mostraram diferenças morfológicas sobre o colágeno normal, apresentando corpo celular arredondado e com pequenos filopódios (Figura 18 A e B). O colágeno glicado dificultou o espraiamento tanto de células C quanto de células D, que se mostraram pequenas e arredondadas (Figura 18 C e D). Sendo assim, o efeito do colágeno glicado em 1 hora foi semelhante sobre células C e D. A área das células aderidas foi medida utilizando-se o programa Image J (NIH), comprovando esta redução no espraiamento sobre colágeno glicado: área de 1.288,00 ± 122,90 vs. 538,40 ± 92,84 µm2 (média ± EPM, *** P<0,005) para células C e de 1089,00 ± 149,90 vs. 359,20 ± 56,81 µm2 (média ± EPM, **, P<0.005 para células diabéticas (Figura 19).

CURVA DE CRESCIMENTO 0 HO RA S 24 HO RA S 48 HO RA S 72 HO RA S 0 2000 4000 6000 8000 10000

Cél. Controle Colágeno Normal Cél. Diabética Colágeno Normal

Cél Controle Colágeno Glicado Cél. Diabética Colágeno Glicado * N ú m e ro d e C é lu la s

Figura 18- Espraiamento celular após 1 hora. (A) Fibroblastos derivados de ratos controle sobre colágeno normal; (B) Fibroblastos derivados de ratos diabéticos sobre colágeno normal; (C) Fibroblastos derivados de ratos controle sobre colágeno glicado e (D) Fibroblastos derivados de ratos diabéticos sobre colágeno glicado. Objetiva de 63X. Verde= F-actina evidenciada com faloidina-Alexa 488. Barra= 50µm.

Figura 19- Área do espraiamento celular após 1 hora. Células derivadas de ratos controle (CTR) e diabéticos (DIAB) sobre colágeno normal e glicado. Análise estatística segundo Anova One way e pós-teste de Tukey (p<0,005). N=25 células por grupo. a*** = diferença significativa entre CTR colágeno normal e CTR colágeno glicado, b**= diferença significativa entre DIAB colágeno normal e DIAB colágeno glicado.

5.2.3 A glicação do colágeno altera o perfil de formação de protrusões de fibroblastos derivados de ratos controle (C) e diabéticos (D)

Durante o processo de migração, as células necessitam emitir a protrusão em direção ao movimento para em seguida realizar a adesão ao substrato. Para avaliar o efeito da glicação sobre a formação de protrusões, foram realizados filmes curtos (30 minutos) com intervalos de 45 segundos e posteriormente foram montados painéis com imagens sequenciais, onde foi traçada a dinâmica de formação dos lamelipódios. As análises qualitativas revelam que células D em colágeno normal formam protrusões que se ramificam, enquanto que células C tendem a formar uma protrusão única ao longo do tempo (Figura 20 A). De forma interessante, ao analisarmos os vídeos de células C e D sobre o colágeno glicado, foi possível observar que os fibroblastos C apresentavam ainda a formação de um lamelipódio único, porém, com um tamanho aparentemente menor. E o lamelipódio do fibroblasto D apresentou múltiplos processos, que permaneceram

múltiplos ao longo de todo o filme (Figura 20 B). Estes resultados sugerem uma menor dinâmica na formação das protrusões.

Figura 20- Análise da dinâmica de formação de protrusão ao longo de 30 minutos. (A) CNC= Fibroblastos derivados de ratos controles sobre colágeno normal e CND= Fibroblastos derivados de ratos diabéticos sobre colágeno normal. (B) CGC= Fibroblastos derivados de ratos controle sobre colágeno glicado e CGD= Fibroblastos derivados de ratos diabéticos sobre colágeno glicado. As imagens foram capturadas a cada 45 segundos, num intervalo de 30 minutos. Objetiva 40X. Zoom manual e contorno do lamelipódio realizado com Image J.

A

5.2.4 A glicação não altera a morfologia de fibroblastos derivados de ratos controles (C) e diabéticos (D)

A análise do citoesqueleto de actina 24 h após o plaqueamento mostrou que os fibroblastos C e D apresentaram-se com morfologia bem semelhante em todos os substratos (Figura 21), com fibras de estresse bem evidentes (resultado não apresentado). Esta morfologia é compatível com de células com uma contratilidade aumentada, associada a uma ativação da proteína Rho A. Quando realizamos a medida da área que as células apresentavam quando em contato com diferentes substratos, não foi observada diferença (Figura 22).

Figura 21- Análise do citoesqueleto de actina após 24 horas de plaqueamento em aumento de 10X. (A) Célula C sobre colágeno normal; (B) Célula D sobre colágeno normal; (C) Célula C sobre colágeno glicado e (D) Célula D sobre colágeno glicado. Vermelho=F-actina. Barra= 100µm

Figura 22- Área do espraiamento celular após 24 horas de plaqueamento. A área das células foi medida através do software Image J. n=20 células por grupo.

5.2.5 Efeitos da glicação sobre a distribuição e expressão de alfa actina de músculo liso (α-SMA)

Embora a distribuição de F-actina e espraiamento celular após 24 horas tenham sido semelhantes em células C e D nos diferentes substratos, houve uma diferença na expressão de α-actina de músculo liso (α-SMA) em resposta ao diabetes. Sobre o colágeno normal, células C apresentaram imunomarcação difusa para α-SMA, distribuída por todo o corpo celular e, algumas vezes, em sobreposição com fibras de estresse (Figura 23 A-C). Este padrão de distribuição foi também observado em células D, mas de forma mais intensa (Figura 23 D-F). Células C em colágeno glicado apresentaram uma distribuição de α-SMA na região central do corpo celular e pouco associada com fibras de estresse (figura 24 A-C). Já as células D em colágeno glicado, apresentaram uma forte marcação de α-SMA associada com as fibras de estresse, sendo esta marcação mais evidente do que os outros grupos comparativos (Figura 24 D-F).

Figura 23- Imunofluorescência para α-SMA em colágeno normal. Células C sobre colágeno normal (A-C) e células D sobre colágeno normal (D-F). (A e D) Verde: anticorpo primário anti- α- SMA; (B e E) Vermelho=F- actina; (C e F) Azul= núcleo. Objetiva 63X. Barra= 20µm

Figura 24- Imunofluorescência para α-SMA em colágeno glicado. Células C sobre colágeno glicado (A-C) e células D sobre colágeno glicado (D-F). (A e D) Verde: anticorpo primário anti- α- SMA; (B e E) Vermelho=F- actina; (C e F) Azul= núcleo. Objetiva 63X. Barra= 20µm.

5.2.6 Glicação do colágeno afeta o comportamento migratório de fibroblastos derivados de ratos controles e diabéticos

O ensaio de migração em time-lapse analisa o perfil migratório de células individuais, fornecendo resultados de velocidade, direcionalidade e distância percorrida relativa. As células C e D foram semeadas sobre os diferentes substratos por 18 horas. Após esse período, as células foram analisadas no microscópio sob condições de temperatura e atmosfera adequadas durante 24 horas adicionais. Conforme esperado, sobre o colágeno normal as células D apresentaram uma redução de 44% na velocidade de migração quando comparadas às células C (43,89 ± 4,07 vs. 24,86 ± 1,96 µm/h ***, média ± EPM, p<0,0001). Sobre o colágeno glicado as células D praticamente não se deslocam, apesar de se movimentarem, quando comparadas às células C (Figura 29).

Nestas condições a velocidade de migração das células C foi reduzida pela glicação do colágeno em 63% (43,89 ± 4,07 vs. 16,52 ± 2,9 µm/h, *** média ± EPM, p<0,0001) (Figura 25), enquanto a velocidade de migração das células D foi reduzida em 44% pela glicação (24,86 ± 1,96 vs. 13,96 ± 1,42 µm/h, * média ± EPM, p<0,0001) (Figura 25). A trajetória das células mostrou que células diabéticas sobre colágeno glicado realizaram deslocamento menor comparado com todas as células dos outros grupos (Figura 26).

Figura 25- Velocidade de migração em time-lapse. Células derivadas de ratos controle (CTR) ou diabéticos (DIAB) foram semeadas sobre 100 µg/ml de colágeno normal ou colágeno glicado. As células foram monitoradas por 24 h e posteriormente analisadas para a determinação da velocidade média. Valores em porcentagem expressam a redução da velocidade de migração entre os grupos que apresentaram diferença estaticamente significativa. Valores estatísticos com p<0.0001, segundo Anova e pós- teste de Tukey. N= 63 células por grupo.

Velocidade de migração celular sobre diferentes subsutratos

0 20 40 60 a*** CTR DIAB COLÁGENO NORMAL COLÁGENO GLICADO CTR DIAB COLÁGENO NORMAL COLÁGENO GLICADO a*** b* V e lo c id a d e ( m /h )

Trajetória de migração celular sobre diferentes substratos

Figura 26- Trajetória da célula em ensaio de migração em time-lapse. Células derivadas de ratos controle (C) ou diabéticos (D) foram semeadas sobre 100 µg/ml de colágeno normal ou colágeno glicado. As células foram monitoradas por 24 h e posteriormente analisadas individualmente. Cada linha mostra a trajetória de uma célula. (A) Células CTR sobre colágeno normal; (B) Células CTR sobre colágeno glicado; (C) Células DIAB sobre colágeno normal e (D) Células DIAB sobre colágeno glicado.

Além da velocidade de migração, obtivemos valores de direcionalidade e distância relativa (menor distância entre o ponto de partida e o ponto final das células). A direcionalidade não foi alterada pela glicação nem pela condição de diabetes (Figura 27 A). Já a distância relativa mostrou-se diferente entre os grupos: sobre colágeno normal as células D tiveram esta distância reduzida em 44% quando comparadas às células C (361,4 ± 28,26 vs. 203,00 ± 18,51 µm, *** média ± EPM, p<0,0001); sobre o colágeno glicado a diferença entre células C e D não foi significativa, em torno de 28% apenas (126 ± 12,95 vs. 90,45 ± 8,9 µm, média ± EPM). A glicação exerceu um efeito maior sobre células C, com

redução de 65% da distância (361,40 ± 28,26 vs. 126,00 ± 12,95 µm, *** média ± EPM, p<0,0001). Células D, por sua vez, apresentaram redução de 55% na distância relativa frente ao colágeno glicado (203,70 ± 18,51 vs. 90,45 ± 8,90 µm, *** média ± EPM, p<0,0001) (Figura 27 B).

Figura 27- Análises da migração de fibroblastos derivados de ratos controle (CTR) e diabéticos (DIAB). (A) Direcionalidade celular, mediada pela razão entre a distância relativa/distância total percorrida. (B) Distância relativa (menor distância entre o início e o final da trajetória). Valores com diferença estatística com p<0.0001, segundo Anova e pós-teste de Tukey. N= 63 células por grupo.

5.2.7 Glicação altera a distribuição da subunidade de integrina β1

Ainda com o objetivo de entender alguns dos fenômenos que ocorrem em células C e D frente ao colágeno glicado, resolvemos avaliar a distribuição de integrinas contendo a subunidade β1 por imunofluorescência. Os resultados mostram que as adesões contendo β1 estão presentes em células C sobre colágeno normal e glicado (Figura 28 A e C), assim como em células D sobre o colágeno normal (Figura 28 B). Células D sobre o colágeno glicado, por sua vez, apresentaram uma marcação em muito fraca para β1.

Figura 28- Imunofluorescência para integrina β1. (A) Célula C sobre colágeno normal, (B) célula D sobre colágeno normal, (C) Célula C sobre colágeno glicado e (D) Célula D sobre colágeno glicado. Objetiva 63 X. Barra= 20µm.

5.2.8 A glicação altera a rigidez e viscosidade do citoesqueleto

O ensaio de OMTC tem como objetivo quantificar as alterações nas propriedades elásticas e viscosas do citoesqueleto. Para a realização deste ensaio, microesferas eletromagnéticas são aderidas a fibroblastos dérmicos derivados de ratos controle (C) e diabéticos (D), semeados sobre colágeno normal ou glicado. Um campo eletromagnético uniforme é imposto sobre as microesferas magnetizadas e um pequeno torque é gerado,

resultando movimento na microesfera e tensão no esqueleto celular. Esse movimento forçado da microesfera é modulado pelas propriedades elásticas e viscosas do citoesqueleto, ocasionando um deslocamento diferenciado. Com campo magnético de 0,5 Hz, o software utilizado detectou em cada campo do microscópio cerca de 100 microesferas, que foram acompanhadas simultaneamente durante a aplicação do campo magnético, gerando os resultados (Figura 29). Observamos uma tendência de redução da rigidez e viscosidade do citoesqueleto de células D em comparação às células C, mas esta diferença foi estatisticamente significativa apenas frente ao colágeno glicado (1,42 ± 0,10

vs. 1,05 ± 0,07* Pa/nm, média ±EPM, p<0,05) (Figura 30). Para o cálculo utilizamos a

média do módulo de armazenamento total (G=Gbsnl), que resulta na somatória de G’ (que mede a resposta gerada pela rigidez do substrato, resultando na movimentação das microesferas) e G’’ (que mede o deslocamento das microesferas resultante das características do citoplasma celular-viscosidade celular). As propriedades viscoelásticas do citoesqueleto de actina e miosina que o uso da técnica de OMTC nos permite avaliar são um reflexo da resposta às forças mecânicas exercidas no substrato. Sabe-se que essas forças mecânicas possuem papel central em processos biológicos como a citocinese e migração celular. A força que a célula exerce é dependente do substrato e suas características, bem como da integração das proteínas do citoesqueleto, integrinas e MEC.

Figura 29- Imagem de cultura de fibroblastos dérmicos com microesferas eletromagnéticas aderidas. As microesferas selecionadas pelo software são analisadas e passadas por critérios de exclusão. Objetiva 20X.

Figura 30- Ensaio de OMTC. Fibroblastos C e D foram semeados sobre colágeno normal e glicado e medidas de viscoelasticidade foram realizadas. Os resultados mostram uma diminuição da rigidez e viscosidade de fibroblastos D em colágeno glicado, quando comparados com fibroblastos em todas as outras condições comparativas. Análise estatística utilizando Anova One way e pós-teste de Tukey, com p<0.05.

OMTC 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 * CONTROLE COLÁGENO NORMAL DIABÉTICO COLÁGENO NORMAL CONTROLE COLÁGENO GLICADO DIABÉTICO COLÁGENO GLICADO P a /n m

5.3 Efeitos da elevada concentração de glicose sobre a contratilidade de fibroblastos NIH-3T3

5.3.1 Alta concentração de glicose não altera a área de espraiamento e o número de células aderidas ao substrato

Conforme já mencionado na introdução e demonstrado neste estudo, fibroblastos derivados de ratos diabéticos ou expostos in vitro a uma elevada concentração de glicose apresentam migração deficiente sobre fibronectina e colágeno I. Resultados anteriores obtidos por nosso grupo sugerem uma deficiência na contratilidade destas células (LAMERS et al., 2011; ALMEIDA, 2011). Para avaliar os efeitos da exposição a uma concentração elevada de glicose (30 mM) durante 15 dias sobre a contratilidade de fibroblastos, inicialmente realizamos o ensaio de adesão por 1 hora ao substrato de fibronectina (1 µg/ml). Após este período, as células aderidas foram fixadas e coradas com faloidina. As análises revelaram que não houve diferença na área de espraiamento das células, nem na quantidade de células que aderiram (Figura 31 A -D).

Figura 31- Ensaio de adesão de células NIH-3T3 cultivadas com glicose 5 mM (LOW) ou glicose 30 mM (HIGH) durante 15 dias em substrato de fibronectina 1 µg/ml por 1 hora. A) Área das células aderidas em μm2. B) Número de células aderidas. C) Evidenciação do citoesqueleto de F-actina nestas células utilizando faloidina conjugada com Alexa-488. Imagens foram capturadas em 10 campos diferentes com objetiva de 10X. A medida da área das células e a contagem do número foram feitas com o software Image J. Barra=20 µm.

5.3.2 Células cultivadas em concentração elevada de glicose apresentam menos fibras de estresse que células controle

Os fibroblastos foram incubados por 24 horas para visualização do citoesqueleto de actina em células plenamente espraiadas e migratórias. As imagens revelaram que as células em meio HIGH (glicose 30 mM) apresentavam menos fibras de estresse quando comparadas com as células em meio LOW (glicose 5 mM). Observamos também que muitos fibroblastos em meio HIGH apresentavam uma cauda longa, aparentando uma dificuldade de retração da mesma (Figura 32). Ao realizarmos a medida da área de espraiamento das células, não observamos diferenças entre os tratamentos (Figura 33).

Figura 32- Citoesqueleto de actina corado com faloidina conjugada com Alexa-488. Células LOW (A e B) e HIGH (C e D) foram semeadas sobre fibronectina (1 µg/ml) durante 24 horas. Branco (F-actina) e azul (núcleo). Objetiva de 63 X. Barra= 10µm.

Figura 33- Quantificação da área de fibroblastos após 24 horas sobre fibronectina (1 µg/ml). Dez (10) campos por grupo foram fotografados (utilizando objetiva de 10 X). A medida foi realizada com programa Image J (NIH).

5.3.3 Fibroblastos em meio HIGH não alteram a polaridade celular comparados com fibroblastos em meio LOW

As mesmas células submetidas ao ensaio de visualização de actina foram analisadas para a polaridade celular, através do cálculo da razão entre as medidas dos eixos maiores e menores da célula (Figura 34). Os valores encontrados mostram que os fibroblastos expostos em meio LOW ou HIGH apresentam perfis de polaridade celular semelhantes, metade (cerca de 50% de células LOW e 47,61% de células HIGH) sendo, portanto, consideradas células polarizadas e muito polarizadas (Tabela 1 e Figura 35).

Figura 34- Figuras ilustrativas dos eixos maior (L) e menor (l) de células LOW e HIGH, utilizados para o cálculo da polaridade celular (eixo maior/eixo menor). Os eixos das células foram medidos utilizando o software Image J (NIH). Dez (10) campos foram capturados com objetiva 63 X. N=65 células por grupo. A= fibroblastos em meio LOW, B= fibroblastos em meio HIGH. Células coradas com faloidina-Rodamina. Barra= 10µm.

Tabela 1- Índice de polaridade dos fibroblastos em meio LOW e HIGH

1 2 e 3 4, 5 e >5

LG 3 (4,83%) 31 (50%) 28 (45,15%)

HG 3 (4,76 %) 30 (47,61%) 30 (47,6%)

Distribuição de células de acordo com seu índice de polaridade, calculado como a razão entre o eixo maior/eixo menor. Valores 1 = não polarizadas, 2 e 3= polarizadas, valores 4, 5 e >5 = muito polarizadas. LG=Low, HG=High. Número de células LOW-62, HIGH=63. L _l L l L l

Polaridade LOW 1 LOW 2-3 LOW 4-5 e > 5 HIGH 1 HIGH 2-3 HIGH 4, 5 e > 5 0 20 40 60 % C é lu la s

Figura 35- Distribuição de células de acordo com seu índice de polaridade, calculado como a razão entre o eixo maior/eixo menor. Valores 0 = não polarizadas, 1-3= polarizadas, valores 4- 5 e >5 = alta polaridade. LG=Low, HG=High. Número de células LOW-62, HIGH=63.

5.3.4 A concentração elevada de glicose altera a morfologia de células NIH-3T3 cultivadas em gel tridimensional (3D) de colágeno e fibronectina

O ambiente tridimensional mimetiza melhor o ambiente in vivo de fibroblastos que o ambiente bidimensional (placas de Petri). Para analisarmos a morfologia e citoesqueleto de actina de fibroblastos nesta condição, confeccionamos géis constituídos por colágeno I e fibronectina com as células imersas na matriz. A fixação foi realizada após 24 horas de