CAPÍTULO 1: Introdução Geral
1.2. Os vírus na cultura de oliveira em Portugal
1.2.1. Os Alpha e Betanecrovirus que infetam a oliveira
O anterior género Necrovirus incluía sete espécies: Tobacco necrosis virus A (TNV-A), Olive mild mosaic virus (OMMV), Olive latent virus 1 (OLV-1), Leek white stripe virus (LWSV), Tobacco necrosis virus D (TNV-D), Beet black scorch virus (BBSV) e Chenopodium necrosis virus (ChNV). Este género era caracterizado por vírus com partículas virais com ≈ 28 nm de diâmetro e um RNA genómico com aproximadamente 3700 nts (King et al., 2012) (Figura 2). Todas estas espécies têm o seu genoma completamente sequenciado à exceção de ChNV.
Em 2011 foi proposta a divisão do género Necrovirus em dois: Alphanecrovirus e Betanecrovirus, baseada no nível de diversidade da polimerase (ICTV alteration proposal, 2011). Em 2012 a nova classificação passou a incluir os vírus OLV-1, OMMV e TNV-A no género Alphanecrovirus e os vírus BBSV, LWSV e TNV-D no género Betanecrovirus. Com esta nova classificação o vírus ChNV passou a género não determinado (ICTV, 2013).
Estudo de um isolado de OLV-1: Caracterização molecular e Resposta à presença de PHPB
Figura 2 – Estruturas do genoma de diversos vírus pertencentes aos géneros Aphanecrovirus e Betanecrovirus (OMMV – Olive mild mosaic virus; TNV-A – Tobacco necrosis virus A; BBSV – Beet black scorch virus; LWSV – Leek
white stripe virus; TNV-D - Tobacco necrosis virus D). As caixas representam as ORFs que codificam as proteínas. RT
– ‘read through’, RdRp – RNA polimerase dependente de RNA, CP – cápside proteica.
São vários os vírus já detetados em oliveira em Portugal (Quadro 2). No entanto, os vírus mais disseminados nos olivais nacionais são os vírus do género Alphanecrovirus OLV-1 e OMMV e o vírus do género Betanecrovirus TNV-D como predominante, atingindo níveis de infeção de 31% (Félix et al., 2012).
1.2.1.1. Olive latent virus 1
O vírus OLV-1 pertencente ao género Alphanecrovirus, família Tombusviridae já foi identificado em oliveira, citrino, túlipa e tomate (Felix et al., 2005, Gallitelli & Savino, 1985, Grieco et al., 1996b, Hasiów-Jaroszewska et al., 2011, Kanematsu et al., 2001, Russo et al., 1994). A importância económica de OLV-1, não é ainda muito clara apesar da sua abundância nos olivais portugueses. A transmissão mecânica a partir de frutos de oliveira induz apenas necroses locais nos hospedeiros Celosia cristata, Chenopodium amaranticolor, Chenopodium quinoa, Cucumis sativus, Cucurbita pepo, Datura stramonium, Gomphrena globosa, Momordica balsamina, Nicotiana cavicola, N. clevelandii, N. glutinosa, N. megalosiphon, N. occidentalis, N.
rotundifolia, N. rustica, N. tabacum, Ocymum basilicum, Petunia hybrida, Phaseolus aureus, Phaseolus vulgaris e Vigna unguiculata. A maioria dos isolados de OLV-1 causam lesões locais e sistémicas em plantas de Nicotiana benthamiana, com exceção do isolado GM6 que apenas causa lesões locais (Félix et al., 2007). N. benthamiana e C. murale são as espécies mais utilizadas para a propagação de isolados de OLV-1. As partículas virais têm um coeficiente de sedimentação de 111 S e um conteúdo em ácido nucleico de cerca de 17% (Gallitelli & Savino, 1985).
Olive latent virus 1 (OLV-1) foi isolado pela primeira vez no sul de Itália a partir de oliveiras assintomáticas, por Gallitelli e Savino (1985). Este vírus voltou a ser detetado em oliveiras sem sintomas na Jordânia (Martelli et al., 1995) e em Portugal (Felix & Clara, 2000), mas também em oliveiras com um acentuado amarelecimento (Savino et al., 1996). Este vírus foi também encontrado em associação com a doença da clorose ananicante dos citrinos (‘Citrus chlorosis dwarf’) na Turquia e em Itália, onde afeta diferentes variedades de citrinos (Martelli et al., 1996). O OLV-1 foi também detetado em túlipas no Japão, as quais apresentavam sintomas de mosaico foliar e listas amarelas (Kanematsu et al., 2001) e em plantas de tomate, na Polónia, as quais apresentavam manchas necróticas foliares (Hasiów-Jaroszewska et al., 2011).
O genoma do primeiro isolado de OLV-1 de oliveira, caracterizado por Félix et al. (2005), consiste numa molécula de RNA de cadeia simples e sentido mensageiro com 3702 nt, com cinco ORFs (Figura 3). As estratégias utilizadas para a expressão do genoma incluem a supressão do codão STOP, sobreposição de ORFs e RNAs mensageiros subgenómicos (Felix et al., 2005).
Figura 3 – Esquema representativo da organização do genoma de Olive latent virus 1. As caixas representam as ORFs que codificam as proteínas p23, p82, p8, p6 e p30 kDa. RT – ‘read through’, RdRp – RNA polimerase dependente de RNA, CP – cápside proteica.
O RNA do isolado GM6 possui 3702 nt de comprimento, enquanto que o RNA dos isolados de citrino e de tomate possuem 3699 nt de comprimento (Grieco et al., 1996b, Hasiów-
Estudo de um isolado de OLV-1: Caracterização molecular e Resposta à presença de PHPB
No isolado GM6 de oliveira, a ORF 1 começa no primeiro codão AUG na posição 61 e termina no codão stop UAG na posição 666, que codifica um polipéptido de 23 kDa (p23). A leitura contínua (‘read through’) do codão stop ‘amber’ da ORF 1 gera um polipéptido com uma massa molecular estimada de 82 kDa (p82), designada ORF 1 RT. De seguida, aparecem, na região central do genoma viral, duas ORFs pequenas, a ORF 2 e a ORF 3 que codificam dois polipéptidos com massa molecular de 8 kDa (p8) e 6 kDa (p6), respetivamente, enquanto, a ORF 4 ocupa a extremidade 3’ do genoma e codifica uma proteína com massa molecular de 30 kDa (p30).
A proteína p82 é provavelmente uma RNA polimerase dependente de RNA (RdRp), pois possui o motivo altamente conservado constituído por uma sequência de três aminoácidos GDD (uma glicina e dois ácidos aspárticos) e outras sequências típicas das polimerases (Félix et al., 2007, Grieco et al., 1996b). As proteínas p23 e p82 são expressas diretamente pelo RNA genómico e ambos os polipéptidos são necessários para a replicação viral. Os polipéptidos p8 e p6 são expressos por um RNA subgenómico (sg1) bicistrónico com 1519 nts e estão envolvidos no movimento do vírus de célula para célula (Castellano et al., 2005). A proteína p30 corresponde à cápside proteica e é expressa por um RNA subgenómico (sg2) com 1237 nts, estando também relacionada com o movimento do vírus a longa distância (Pantaleo et al., 1999). Em termos de comparação com o isolado de OLV-1 de citrino, a proteína p82 (RdRp) tem uma identidade de sequência de 97,3%, as proteínas p8 e p6 têm uma identidade de sequência de 93,2% e 100%, respetivamente e a cápside proteica tem uma identidade de sequência de 87,7% (Felix et al., 2005). Em comparação com o isolado de OLV-1 de túlipa, a cápside proteica tem uma identidade de sequência de 98,5% (Kanematsu et al., 2001). Por fim, em comparação com o isolado CM1 de OLV-1 identificado em tomate, a RdRp tem uma identidade de sequência de 98,4%, as proteína p8 e p6 têm uma identidade de sequência de 100% e a cápside proteica tem uma identidade de sequência de 92,2% (Hasiów-Jaroszewska et al., 2011).
Em comparação com os restantes Alpha- e Betanecrovirus, a RdRp, correspondente à RdRp, tem uma identidade da sequência de 92,1% com o OMMV, 90,7% com o TNV-A, 34,1% com o TNV-D, 33,3% com o LWSV e 34,8% com o BBSV, enquanto a cápside proteica, tem uma identidade de sequência de 43,3% com o OMMV, 41,5% com o TNV-A, 42,5% com o TNV-D, 28,2% com o LWSV e 36,3% com o BBSV (Félix et al., 2007).