Os dados do estiramento do DNA e do complexo DNA-ligante

Do modo como operamos a pinça óptica, ela nos proporciona o objetivo experimental de observar e extrair o comportamento mecânico do DNA e dos complexos DNA-ligantes. Obser- vamos o DNA e complexos em uma solução aquosa, que é formulada com acuidade para que se aproxime ao máximo de condições fisiológicas. Assim se faz necessário, pois todo DNA

em condições “naturais” possui propriedades mecânicas bem definidas, que possuem varia- bilidade na extensão, mas, possuem elasticidade compatível nos mais diversos tipos de seres vivos. Desta forma, ao complexarmos o DNA com possíveis ligantes, os parâmetros mecâni- cos sofrerão alterações, refletidos pela físico-química da interação. Muitas vezes, é possível estabelecer uma conexão entre o comportamento mecânico com a físico-química que governa a interação entre o DNA e o ligante [19]. Para executar a extração dos dados mecânicos devemos proceder de forma cautelosa, pois ambicionamos obter dados que refletem a estruturação e/ou conformação de equilíbrio de um DNA e suas mudanças quando no interior celular. Para tanto, é fundamental que tomemos o cuidado de trabalhar dentro de um regime de forças baixas, cha- mado regime entrópico, pois existem evidências experimentais e teóricas de que assim ocorre no interior das células [48]. Desta forma, disponibilizaremos estudos confiáveis e capazes de contribuir nas mais diversas áreas relacionadas às ciências físicas, químicas e biológicas.

Pela descrição de como atua a pinça óptica e também pela descrição do método de cálculo da constante de força da pinça, deixou-se claro a importância do objeto dielétrico, no caso as microesferas de poliestireno, para experimentos como o nosso. É a microesfera que permane- cerá aprisionada no poço potencial da pinça durante o estiramento do DNA. A força capaz de estirar o DNA atua sobre ele de maneira indireta. Portanto, o DNA alvo de nossa observação estará preso à microesfera de poliestireno e o processo no qual ocorre este aprisionamento será descrito adiante. Na nossa montagem de pinça, o poço potencial não é deslocado, ele possui um posicionamento fixo. É necessário então, que, além de afixado à microesfera, o DNA esteja também afixado ao ponto que terá movimentação durante o experimento. Como já dito antes, a movimentação ocorre através de um estágio piezoelétrico, onde também prendemos o porta- amostra com todo o material a ser testado. Assim fica também definido que o DNA alvo estará afixado a uma lamínula de vidro, que por sua vez é o fundo do porta-amostra. A fixação do DNA à lamínula também será descrita mais à frente.

Na figura 3.9, está esquematizado simploriamente o que pode ocorrer com todo o mate- rial que compõe a solução aquosa que é a amostra de trabalho. Nesta solução estão contidas as microesferas, o DNA, a solução tampão e muitos outros elementos que pertencem a alguma etapa de realização do experimento. No experimento real a maior parte das microesferas estarão soltas em solução e somente uma pequena parte delas terá uma ponta do DNA afixado nelas. Para que consigamos tensionar o DNA, devemos fazer uma busca por uma configuração onde o DNA esteja duplamente afixado e que ainda tenha um DNA com todas as características pa- drões preservadas. Esta busca pode durar por quase todo um dia de experimento, ou até mesmo vários experimentos para ser encontrada. É nessa busca que se encontra o maior gasto de tempo e material de trabalho, podendo tornar difícil e de alto custo a realização do experimento.

Figura 3.9: Possíveis configurações da solução no porta-amostra. Adaptada da referência [23]

A figura 3.9 evidencia também que pode haver muito DNA solto em solução, microesferas agarradas ao fundo da lamínula, DNA’s presos pelas extremidades a duas microesferas e outras configurações não desejadas. Uma só microesfera pode também conter mais de um DNA fixado a ela e ao fundo da lamínula, o que também inviabiliza esta configuração para o experimento, já que nosso experimento é de molécula única. Ainda podemos ver na figura algumas repre- sentações de proteínas e vitaminas que otimizam o processo de fixação do DNA à lamínula e à microesfera; tais elementos estarão descritos nas próximas seções.

Começamos manualmente nossa busca, movimentando o estágio piezoelétrico ao girar seus parafusos micrométricos, até que uma microesfera seja pinçada. Após o pinçamento, movi- mentamos o estágio e, se a microesfera contiver DNA na condição ideal, ou em perfeito estado, o DNA exercerá sobre a microesfera uma força, como se fosse uma mola distendida, e a fará escapar da pinça. Quando o conjunto microesfera-DNA for encontrado, verificamos se há in- dícios de que uma única molécula de DNA está presa à microesfera. O melhor método para testarmos esta possibilidade é fazer a microesfera escapar da pinça por vários lados diferentes, observando se a distância percorrida pela microesfera é sempre a mesma. A figura 3.10 ilustra bem essa situação.

O DNA com o qual realizamos nossas pesquisas é o DNA do bacteriófago λ, que tem como padrão um comprimento de contorno Lc ≅ 16, 5 x 10

−6 _{m e um comprimento de persistên-}

cia A ≅ 50x10−9

m. Após encontrarmos a microesfera com o DNA duplamente preso iremos estirá-lo para testar se seus comprimentos possuem as medidas padrões citadas. Neste momento faz-se um estiramento filmado do DNA, tendo os controles de toda a movimentação realizado pelo computador e pelo deslocador do piezoelétrico. Deve-se inclusive realizar a filmagem em uma velocidade baixa o suficiente para que a perturbação gerada no sistema possa ser despre- zada. A gravação do filme possui dados em frames e pixels, conforme as características da câmera CCD, mas devem ser convertidos em micrômetros e segundos. Os dados com as me- didas em unidades do SI são então resolvidos pela expressão de Marko e Siggia, dada pela equação 2.31, que pertence a um regime de forças no qual nossos dados se inserem [16, 29]. A força executada pela pinça possui duas componentes: transversal (no plano da lâmina) e axial (perpendicular à lâmina), com o eixo x sendo a componente no plano. Entretanto tomaremos apenas a componente x, pois o deslocamento será ao longo deste eixo. Na figura 3.11 pode-se perceber a direção do estiramento e acompanhar a decomposição da força.

Figura 3.11: Estiramento do DNA ao longo de sua extensão. Note Fx= F cos θ = F (xDN A/z) e

z =qx2

DN A+ h2. A microesfera sofre forças de módulos iguais pela pinça e pelo DNA.

Com a velocidade constante e com intensidade muito baixa (v = 0, 1 µm/s) pode-se con- siderar que a solução não exerce força de arraste sobre a microesfera e também que em volta do DNA a perturbação é suficientemente pequena para considerarmos que o DNA passa por sucessivas posições de equilíbrio. Este arranjo dá ao sistema uma configuração de regime quase estático, onde a força de Stokes é desprezível e o DNA começará a exercer uma força siginifi- cativa sobre a microesfera quando o deslocamento estiver próximo do valor do comprimento de contorno do DNA (Lc). Deste ponto em diante ele começa a exercer uma força sobre a micro-

esfera que é de igual intensidade à força da pinça. A figura 3.12 representa uma curva de força por estensão típica do DNA em sua forma nativa e confirma as considerações acima.

Figura 3.12: Curva de força típica de um DNA em sua forma nativa. Note o valor máximo de 2 pN para a força dentro do regime entrópico e também os valores de ajuste do KaleidaGraph no qual m1 representa o comprimento de persistência e m2 é o comprimento de contorno.

Os dados são ajustados pela equação de Marko e Siggia, que ao longo da direção x é escrita como: Fx = F cos θ = F (xDN A/z), (3.5) onde; z = q x2 DN A+ h2, (3.6) e a equação se torna: F = kBT A   p x2 DN A+ h2 Lc + 1 4(1 − √ x2 DN A+h2 Lc ) 2 − 1₄   xDN A p x2 DN A+ h2 , (3.7)

em que h, kB e T são constantes.

O ajuste da curva de Fx em função de x fornece com precisão os parâmetros mecânicos

A e Lc. Realiza-se o ajuste usando o programa KaleidaGraph desde o tratamento dos dados

nas conversões em dados no SI até a geração da curva e extração dos parâmetros de interesse. Como o exemplo da curva acima revelou dados de um DNA padrão do bacteriófago λ, este DNA pode ser então usado para as observações de mudanças de parâmetros mecânicos devido à interação com o ligante a se pesquisar. Entretanto, se um DNA encontrado não atende às exigências, todo o processo de busca deve ser reiniciado desde a etapa manual. Apesar de to- dos os cuidados citados acima, no processo de preparo das amostras a manipulação do DNA

leva à danificação de muitas unidades e este fato pode obrigar a que novas buscas por um DNA padrão sejam reiniciadas inúmeras vezes. Para maior confiabilidade dos dados, consideramos o DNA ideal para a continuidade do experimento, quando os ajustes levam aos valores padrões em pelo menos cinco repetições do estiramento. Os valores padrões devem atender à média de Lc = (16, 5 ± 1, 0)µm para o comprimento de contorno e A = (45 ± 5)nm para o comprimento

de persistência, conforme estimativa citada na seção 2.5.

A partir do momento em que o DNA padrão é encontrado, começamos a fazer a troca da so- lução no porta-amostra. As novas soluções contém as alíquotas com as concentrações desejadas do ligante que irá interagir com o DNA. Para cada ligante temos que estabelecer diferentes cri- térios de concentração e tempo de reação com o DNA. Os valores iniciais para as concentrações são obtidos na literatura disponível, mas como para cada técnica pode haver comportamentos distintos devido a suas particularidades, devemos observar atentamente a faixa de concentração importante para nosso experimento. Fazemos os estiramentos desde o DNA puro até a alíquota final de interesse repetidas vezes, em média cinco vezes para cada DNA, e ainda repetimos o experimento com moléculas de DNA diferentes. Ao final tomamos o valor médio das diferentes moléculas e calculamos as barras de erro em função das médias de todas as moléculas.

A figura 3.13, esboça o esquema do porta-amostra utilizado, cujos detalhes de construção encontram-se mais à frente. Um momento muito delicado do experimento é o de troca da solu- ção do porta-amostra. A figura mostra um modelo de pipeta com o qual realizamos tais trocas. Primeiramente devemos tentar retirar o máximo da solução do porta-amostra, mas sem compro- meter a estrutura do DNA, o que exige muito cuidado. Fazemos isso retirando pequenas porções por vez, geralmente de 10 em 10 µL, para não perturbar excessivamente o sistema. Após a re- tirada inserimos também em pequenas porções a alíquota contendo a concentração desejada do ligante. Para cada alíquota este processo é repetido por três vezes para garantirmos uma troca total da solução. Cada experimento necessita da construção de um novo porta-amostra que re- cebe uma solução de volume aproximado de cem microlitros de solução (Vi ≈ 100 µL). Se

nesta troca de solução o DNA for perdido, devido a algum movimento brusco por exemplo, um novo experimento deve ser iniciado.

Figura 3.13: Esquema do porta-amostra e troca de alíquota. Na troca a microesfera deve perma- necer pinçada e o DNA duplamente preso.

3.5.2 Preparo das amostras - pinça óptica

O DNA do bacteriófago λ com o qual trabalhamos passa por um processo de biotinilização, ou seja, de marcação de suas extremidades com a vitamina biotina. Este processo é feito em nosso laboratório e é previamente executado para que se tenha sempre disponível o DNA bioti- nilado, o qual chamamos λ-biot. Ele é justificado pois trabalhamos com o protocolo de Smith e Bustamante [49], em que as extremidades do DNA são ligadas à microesfera e ao fundo da lamínula pela afinidade entre a vitamina biotina e a proteína estreptavidina. Trabalhamos num regime de forças da ordem de piconewtons (pN), e através do referido protocolo esse regime de forças não é suficiente para desprender as extremidades do DNA do fundo da lamínula ou da microesfera.

Para se ter um experimento bem sucedido o DNA deve permanecer duplamente afixado du- rante todos os estiramentos pelos quais passará, desde a busca manual até a última troca de alíquota, o que pode girar em torno de 50 estiradas. Se a ligação entre o DNA com a microes- fera e/ou com a lamínula de vidro for fraca, haverá uma grande probabilidade de o mesmo se desprender durante o experimento. Adquirimos a microesfera já recoberta com estreptavidina pelo fabricante e com 3 µm de diâmetro. Já a lamínula de vidro passa por um processo de reco- brimento durante a construção do porta-amostra e para este recobrimento da lamínula usamos o método de Amitani [50]. Simultaneamente preparamos a solução com microesferas e DNA e também procedemos à montagem do porta-amostra, como descrito.