CAPÍTULO 1 ENQUADRAMENTO TEÓRICO
1.2. GESTÃO DE DESEMPENHO PROFISSIONAL
1.2.5. Os Intervenientes no Processo de Gestão de Desempenho
3.1.3.1 Evaluation de I' interférence du chlorure
Conditions préliminaires
Pour pouvoir comparer les incorporations d' '^^1' et de ^^Cl":
1) Il est nécessaire que les mesures soient réalisées lorsque les activités spécifiques
des 2 isotopes sont similaires: le chlorure radioactif n' étant pas disponible à
haute activité spécifique, cette condition n' est réalisée que lorsque les
concentrations extravésiculaires d'I" ou de Cl' valent 7,7 mM.
2) Il est important de s' assurer de l'incorporation intravésiculaire des 2 isotopes: la
perméabilisation des vésicules par le détergent neutre triton ( 1 %) abolit 1' influx
initial d'I' et de Cl' (figure 3.11).
Cinétiques
Les cinétiques sont réalisées séparément et conjointement (double comptage), en
présence d'un gradient de potassium entrant (C^^ = 100 mM et Ck^ = 0 mM). La figure
3.11 représente les captations conductives d' et de ^*C1' mesurées dans ces
conditions.
L' influx initial d' I" est à peine affecté par la présence d' une concentration
équimolaire de Cl', passant de 2,4 à 2,2 nmol/mg et est 4 fois supérieur à 1' influx initial
de Cl' mesuré en absence d' I' (0,52 nmol/mg). Par contre, en présence d' I', 1' influx
initial de Cl' est réduit à 0,29 nmol/mg, mettant en évidence 1' interférence de 1' I' sur la
captation de Cl'. Les captations à 1' équilibre (approximativement à 120 min.) sont plus
élevées pour 1' I' que pour le Cl', ce qui signifie que les volumes de distribution des 2
isotopes sont différents. Le calcul de ces volumes est estimé par le rapport de 1'
incorporation à 1' équilibre divisé par la concentration de 1' anion. Il est de 0,2 pl/mg de
protéines pour 1' I' et 0,1 pl/mg de protéines pour le Cl'. Ceci suggère 1' existence de 2
populations de vésicules et de 2 populations de canaux différents.
[CI] (mM)
Fig. 3.12: Effet du chlorure: gradient de potassium entrant.
L'influx initial conductif d’ (10 pM) est mesuré en présence de concentrations
croissantes de chlorure. U osmolarité du milieu extravésiculaire est maintenue constante
(n = 3).
O)
I
O
E
Q.
(D
ni
Q.
3
800
600
400
200
0
“\
_ •
\
\
\
l
'\
\
\
I I
0
T
4 6 8
I" uptake (nmol/mg)
Fig. 3.13: Dépendance de la concentration d'iodure: gradient de potassium entrant,
représentation selon Eadie-Hofstee.
L'influx initial conductif d' est mesuré en présence de concentrations variables d'
iodure croissantes (de 1 pM à 25 mM). L'osmolarité du milieu extravésiculaire est
maintenue constante (n = 3).
Effet de concentration croissantes de chlorure
L' influx initial a été étudié en présence de concentrations croissantes de Cl" non
radioactif dans le milieu extravésiculaire (de 1 à 100 mM), la concentration d' T étant
de 10 pM, en présence d'un gradient de potassium entrant =100 mM et Ck^ = 0
mM).
La figure 3.12 montre que 1' inhibition de la captation d'I" est extrêmement faible,
étant à peine de ± 25% pour une concentration de Cl" pourtant 10.000 fois supérieure
(100 mM): cette captation démontre une haute sélectivité pour l'iodure.
3.1.3.2 Dépendance de la concentration d'iodure
L' influx initial a été mesuré, en présence d'un gradient de potassium entrant (Ck^ =
100 mM et = 0 mM) à des concentrations d'I" extravésiculaires variant de 0,1 pM à
50 mM (figure 3.13).
La représentation selon Eadie-Hofstee suggère la présence de 2 composantes: la
première, ayant une haute affinité pour 1' I", se situe dans la zone de concentration d'I*
variant entre 0,1 et 100 pM et présente un Km apparent de 70 pM, la deuxième, ayant
une basse affinité pour 1' I", se situe dans une zone de concentration de 1' ordre du mM
et présente un Km apparent de 33 mM. La composante à haute affinité est appelée canal
à iodure tandis que la composante à basse affinité est un canal anionique conduisant
chlorure et iodure.
O
U.
Q.
O)
E
O
E
Q.
0)
03
Q.
3
Fig. S. 14: Effet des anions: gradient de potassium entrant.
Le contrôle représente l'influx initial conductif d' (10 pM), en présence de
Kgluconate (100 mM). Les anions sont ajoutés à la concentration de 50 mM dans le
milieu extravésiculaire dont /' osmolarité est maintenue constante (n = 3).
[CIOJ (mM)
Fig. 3.15: Effet du perchlorate.
Les influx initiaux conductifs d' (10 pM:
cercles noirs ou 7,7 mM: triangles) et de ^^Cl"
(7,7 mM:cercles blancs) sont mesurés en présence de
concentrations croissantes de perchlorate et exprimés
en % de V influx initial conductif en absence
d'inhibiteur (n = 3).
[I ] or [CI ] (mM)
Fig. 3.16: Captation de pertechnétate
U influx initial conductif de ^^"'Tc' est mesuré
en présence de concentrations croissantes d'
iodure (cercles noirs) ou de chlorure (cercles
blancs) (n = 3).
3.1.3.3 Effet d'inhibiteurs
Anions
L' effet des anions est évalué sur la eomposante à haute affinité: 1' influx initial d'I"
(Ci^ =10 |iM) est mesuré en présence d'un gradient de potassium entrant (Ck^ = 100
mM et Ckj = 0 M) lorsque différents anions sont ajoutés, sous forme de leur sel de
potassium, à la concentration de 50 mM dans le milieu extravésiculaire (1' osmolarité
extravésiculaire est maintenue constante).
La séquence inhibitrice des différents anions est représentée par la figure 3.14 et
démontre la haute sélectivité pour 1' I". Bien qu' aucun anion ne se révèle
particulièrement actif, le perchlorate s' avère le plus puissant et différentes
concentrations (de 100 pM à 100 mM) ont été testées sur 1' influx initial d'T = 10
pM et 7,7 mM) et de Cl' (Cd^ = 7,7 mM) en présence d' un gradient de potassium
entrant (Ck^ = 100 mM et C^. = 0 mM).
Le perchlorate inhibe faiblement 1' influx initial de la composante à haute affinité
(Ci^ = 10 pM), la CI50 étant de 3,5 mM, et est nettement plus actif sur la composante à
basse affinité, la CI50 étant de 6,5 mM et de 2,2 mM, respectivement pour 7,7 mM d'I'
et de Cl' (figure 3.15). Cette inhibition différentielle du perchlorate lorsque les
concentrations d'I' sont de 10 pM et de 7,7 mM confirme la présence de la composante
à haute affinité c' est-à-dire du canal à iodure.
Pertechnétate
Le pertechnétate est un anion n' existant que sous forme radioactive (®®‘"Tc04'). Il
est couramment utilisé en clinique, notamment lors de la réalisation de scintigraphies
thyroïdiennes, étant concentré dans la cellule folliculaire par le cotransport Na'*'-!'. Par
ailleurs, il est parfois utilisé dans 1' étude de la perméabilité des canaux anioniques
épithéliaux (57).
L' influx initial de ^®'"Tc04' est mesuré en présence de concentrations
extravésiculaires variables d'I' et de Cl'. La CI50 de 1' I' (0,55 mM) est environ 5 fois
plus faible que la CI50 du Cl' (3 mM) (figure 3.16).
100
80
-d) 60
-
Q-3
40
20
-0
NPPB Fluf. lAA 94/95 DPC DIDS
Fig. 3.17: Effet des inhibiteurs des canaux au chlorure sur la composante à basse affinité:
gradient de potassium entrant.
Différents inhibiteurs, à la concentration de 100 fiM, sont testés sur /' influx
initial conductif d'(7,7 mM, barres grises) ou de (7,7 tnM, barres
blanches). Les résultats sont exprimés en % de /' influx initial conductif d' ^^^F
en absence d'inhibiteur (n = 3).
Fig. 3.18: Effet des inhibiteurs des canaux au chlorure sur la composante à haute affinité:
gradient d'iodure sortant.
Différents inhibiteurs, à la concentration de 100 pM, sont testés sur F influx
initial conductif d' '^^F (I pM). Les résultats sont exprimés en % de /' influx
Inhibiteurs des canaux au chlorure
Composante à basse affinité
La figure 3.17 représente 1' effet de divers inhibiteurs des canaux anioniques (100
pM) , sur r influx conductif initial, mesuré en présence d' un gradient de potassium
entrant, lorsque Ci^ et Cci^ = 7,7 mM. Aucun des inhibiteurs n' est réellement actif sur 1'
influx d' '2^r. Par contre, le NPPB et le flufénamate inhibent significativement 1' influx
de ^®C1', respectivement de ± 85 et 75%.
Composante à haute affinité
La figure 3.18 représente 1' effet des mêmes inhibiteurs (100 pM), sur 1' influx
conductif initial d'mesuré en présence d'un gradient iodure sortant, lorsque =
1 pM,
Le DPC et surtout le DIDS, sont de puissants inhibiteurs et leur efficacité contraste
avec la faible inhibition qu' ils exercent sur la composante à basse affinité. Le NPPB,
par contre, est quasi inactif.
100 n
80
-Fig. 3.19: Effet du MMI: gradient d'iodure sortant.
V influx initial conductif d' (1 fiM) est mesuré en présence de concentrations
croissantes de MMI et exprimé en % de V influx initial conductif d'en
absence d'inhibiteur (n =2).
3.1.3.4 Effets d'agents oxydants et réducteurs sur le canal à iodure
Réducteurs
La présence de TPO dans la préparation de vésicules de membrane plasmique
(enrichie environ 20 fois) risque d'entraîner une surestimation de 1' incorporation d'
dont une partie est transformée en
La TPO n' est pas complètement inhibée à 4°C.
Le MMI est un puissant inhibiteur de la TPO qui agit par réduction des groupes
sulfhydryl de 1' enzyme (23,30).
Lorsqu' un gradient de potassium entrant est imposé, 1' incorporation d' est
réduite d' environ 90% par 1 mM de MMI. Les 10% d' incorporation résiduelle sont
sensibles à l'imposition d'ime différence de potentiel membranaire (lors de 1' addition de
valinomycine en présence d'un gradient de potassium), indiquant que le canal à iodure
n' est en tous cas pas totalement inhibé par le MMI.
Par contre, dans les conditions d'un gradient d'iodure sortant, 1 mM de MMI inhibe
totalement l'incorporation d' '^^I".
L' explication pourrait en être la suivante:
Les vésicules sont probablement orientées "inside-out", c' est-à-dire que le site actif
de la TPO, normalement situé dans la colloïde est présent à 1' intérieur des vésicules.
En présence d'un gradient de potassium entrant, il n' y a pas d'iodure à 1' intérieur
des vésicules et 1' ’^^I" incorporé peut être rapidement transformé en '^^l2 par la TPO. L'
addition de MMI inhibe la TPO et réduit considérablement 1' entrée d' ‘^^I‘ qui reste
cependant sensible à la différence de potentiel. Cependant, dans ce protocole
expérimental, il est difficile d'évaluer dans quelle mesure le MMI inhibe également le
canal à iodure.
Par contre, dans les conditions du gradient d' iodure sortant, 15 mM d' T non
radioactif sont présents à 1' intérieur des vésicules et constituent donc le substrat quasi
exclusif de la TPO; en outre, ils protégeraient la TPO de 1' effet inhibiteur du MMI
(23,30).
Dans ces conditions, 1' effet du MMI sur le canal à iodure a pu être testé: la courbe
dose-réponse permet d'évaluer la CI50 du MMI, de 1' ordre de 0,5 pM (figure 3.19).
L' effet inhibiteur du MMI sur I' incorporation d' ’^^I" est également reproduit sur
protéoliposomes où la TPO, même si elle était encore présente, n' est probablement plus
fonctionnelle (dénaturation par le détergent, élimination de tout éventuel cofacteur
contaminant la préparation de vésicules).
100 1 100 n
[NADH] (mM) [NADPH] (|
j
M)
Fig. 3.20: Ejfet du NADH et du NADPH: gradient d'iodure sortant.
L'influx initial conductif d' (1 fiM) est mesuré en présence de concentrations
croissantes de NADH ou de NADPH et exprimé en % de /' influx initial conductif
D' autres agents réducteurs comme le DTT ou la L-cystéine reproduisent, à la
concentration de 100 pM, 1' effet inhibiteur du MMI, en présence d' un gradient d'
iodure sortant.
Par ailleurs, dans les mêmes conditions, divers agents réducteurs généralement
présents dans le cytoplasme, comme le NADH, le NADPH et le glutathion réduit,
inhibent également 1' incorporation d'
Ces composés n' étant pas des inhibiteurs coimus de la TPO, leur effet s' exerce
obligatoirement sur le canal et la figure 3.20 représente leur courbe dose-réponse.
Le canal à iodure est donc une protéine possédant des groupes thiols dont 1' intégrité
est nécessaire pour assurer la conductance à l'iodure.
Oxydants
A la concentration de 100 pM, et dans les conditions d'un gradient iodure sortant,
les formes oxydées NAD"*", NADP"*" et le glutathion oxydé sont sans effet sur 1'
incorporation d'
De plus, les couples redox NADH/NAD"'' (dans les rapports 0,01; 0,05 et 0,3 pour
une concentration de NADH de 30 pM) et NADPH/NAPD"^ (dans les rapports 0,2; 1 et
3 pour une concentration de NADPH de 30 pM) produisent la même inhibition que le
NADH ou le NADPH seuls.
I'
u
p
ta
k
e
(p
m
o
l)
7
-/
(U
O èoo ; —O
0 30 60 90 120 150 180
O
time (min.)
Fig. 3.21: Cinétique de la captation d' .protéoliposomes (10/90).
La captation d' fl pM) est mesurée en absence (cercles noirs) et présence de
valinomycine (cercles blancs) (n = 2).
3.00 -
2.40 -
1.80 -
1.20
-
0.60 -
0.00
Fig. 3.22: Spécificité de la captation d' : protéoliposomes (60/90).
L'influx initial conductif d' (1 pM) est mesuré au niveau de: 1)
protéoliposomes reconstitués avec les protéines membranaires thyroïdiennes,
2) liposomes et 3) protéoliposomes reconstitués avec la bactériorhodopsine
(n = 3).
proteolipo
(thyroid)
pure
lipo
proteolipo
(bacterio)
3.2 Solubilisation et reconstitution du canal à iodure
