Otimização da Técnica de Macroarranjos de DNA a partir de Colônias

4.1.1 Determinação do Tempo de Crescimento das Bactérias em Membranas de Náilon

Inicialmente foram avaliados dois tempos de crescimento bacteriano (6 ou 12 horas) para se determinar o mais indicado para a confecção de macroarranjos de DNA utilizando-se colônias bacterianas. Membranas contendo 4.608 clones em duplicata foram hibridizadas com a sonda overgo. As imagens destas membranas foram capturadas pelo sistema de análise de imagens FLA-3000G Image Analyzer. A Figura 13 mostra um quadrante das membranas onde colônias bacterianas cresceram por 6 horas (quadro à esquerda) e 12 horas (quadro à direita). No quadro central da Figura 13 está representado o arranjo 5x5 dos clones bacterianos usado neste experimento. Observou-se, através destas imagens, que os clones crescidos por 6 horas são mais uniformes e estão mais distantes uns dos outros quando comparados com os crescidos por 12 horas. Depois de capturadas, as imagens foram quantificadas e analisadas utilizando-se o programa Array Vision Evaluation versão 6.0.

O processo de normalização foi realizado utilizando-se os valores de leitura transformados obtidos para cada um dos experimentos. De acordo com o item 3.1.3.2, foram selecionados para análise 3.954 clones (85,8% do total) nas membranas onde as bactérias foram crescidas por 6 horas. Estes

clones foram selecionados por apresentarem quantidades similares de plasmídeo em suas réplicas. Da mesma maneira, foram selecionados 4.017 clones (87,2%) para colônias bacterianas crescidas por 12 horas. No entanto, colônias bacterianas crescidas por 12 horas sobrepunham-se umas as outras, elevando o resíduo de fundo. O valor médio do resíduo de fundo foi de 68 para bactérias crescidas por 6 horas e de 371 para as crescidas por 12 horas, confirmando o observado na Figura 13.

10 10 07 03 03 11 09 07 04 02 11 09 04 02 12 08 06 05 01 12 08 06 05 01

Figura 13 – Quadrante das membranas com arranjo 5x5 hibridizadas com a sonda overgo. À esquerda tem-se uma representação das colônias bacterianas crescidas por 6 horas na membrana de náilon. Do lado oposto estão as bactérias crescidas por 12 horas. Ao centro está o esquema do arranjo de colônias bacterianas utilizado na confecção destas membranas, onde números iguais correspondem ao mesmo clone

Através da normalização com a sonda overgo, realizou-se análise de variância para verificar a existência de diferenças entre repetições dos clones na mesma membrana, e entre repetições dos clones em diferentes membranas, de acordo com Gomes (2000). Foi encontrado que os valores de leitura transformados dos 3.954 clones crescidos por 6 horas na membrana de náilon são diferentes entre si (Pr<.0001) (Tabela 2). Isto significa que os clones

apresentaram diferentes quantidades de plasmídeo entre si. Estas diferenças podem ser causadas devido aos diferentes produtos gênicos presentes nestes clones. De acordo com Baneyx (1999), indutores do promotor do operon lac podem estar presentes em células bacterianas e, se forem induzidos, podem produzir proteínas tóxicas à célula. Assim, a utilização das mesmas cepas de

Escherichia coli e de vetores pSPORT1 para todas as colônias bacterianas não

garante um crescimento uniforme para os diferentes clones. De acordo com a análise estatística apresentada na Tabela 2, nas membranas onde as bactérias cresceram por 6 horas não houve diferença significativa entre a quantidade de plasmídeo das repetições de um mesmo clone na mesma membrana [spot(memb)] e nem entre membranas (clones*memb). Estes dados indicam que o número de plasmídeos para um determinado clone é similar em todas as repetições e membranas, ou seja, não houve interação entre o crescimento bacteriano e o ambiente onde ele estava crescendo.

Tabela 2. Análise conjunta para colônias bacterianas crescidas por 6 horas sobre a membrana de náilon em arranjo 5x5

Causa de Variação GL SQ QM Pr>F Memb 1 1.935088 6.25 0.0124 spot(memb) 2 0.031380 0.10 0.9035 ** clone 3953 1.240875 4.01 <.0001 * clone*memb 3953 0.199890 0.65 1.0000 ** * valor significativo **

As colônias bacterianas crescidas por 12 horas também apresentaram diferenças entre diferentes clones dentro da mesma membrana (Tabela 3). No entanto, estes clones não apresentaram um comportamento similar entre as membranas (clone*memb Pr<.0001). Os dados da análise de variância descritos na Tabela 3 indicam que o crescimento bacteriano por 12 horas foi influenciado diferencialmente pelos recursos e espaço disponíveis. Nesta análise também foi possível observar que as diferenças entre repetições dos clones dentro da mesma membrana foram não significativas.

Devido à presença de um baixo valor de resíduo de fundo e da ausência de interação entre clone e membrana, o tempo de 6 horas de crescimento das bactérias nas membranas de alta densidade foi adotado para a confecção do segundo conjunto de macroarranjos. Estes resultados são contrários ao sugerido por Nizetic et al. (1991) e Hemberger et al. (2001), que recomendam um crescimento de 12 horas. Entretanto, acredita-se que esta variação seja dependente de cada experimento, não sendo possível extrapolar para todos os tipos de ensaios.

Tabela 3. Análise conjunta para colônias bacterianas crescidas por 12 horas sobre a membrana de náilon em arranjo 5x5

Causa de Variação GL SQ QM Pr>F memb 1 0.2361289 2.90 0.0886 spot(memb) 2 0.0128521 0.16 0.8540 ** clone 4016 0.2326057 2.86 <.0001 * clone*memb 4016 0.1164171 1.43 <.0001 * * valor significativo **

4.1.2 Contagem do Número de Unidades Formadoras de Colônias

Com o objetivo de confirmar que o uso de macroarranjos com colônias bacterianas é melhor quando estas são crescidas por 6 horas, foi realizada a contagem do número de unidades formadoras de colônias por µl (UFC/µl).

Quando incubado à 37ºC por 6 horas, o clone SCCCAM1C08E06 apresentou 6.835 UFC/µl, e quando incubado à 37ºC por 12 horas, o clone apresentou 9.835 UFC/µl. Estes resultados, quando plotados na curva de crescimento padrão para bactérias E. coli, mostraram que com um número de bactérias viáveis da ordem de 6.000 a 7.000 UFC//µl a cultura se encontra em fase exponencial de crescimento (Figura 14). De acordo com esta curva, o número de UFC/µl obtido para 12 horas de crescimento (9.835 UFC/µl) indica que a cultura já se encontra em fase estacionária (Figura 14). Estes resultados confirmam que a adoção do tempo de crescimento de 6 horas é o mais adequado para a confecção das membranas de alta densidade.

Figura 14 – Curva de crescimento padrão para Escherichia coli Fonte: adaptado de Alterthum & Carvalhal (1999)

4.2 Análise da Expressão Gênica em Resposta à Herbivoria