Para o desenvolvimento do método cromatográfico foi escolhida a classe de compostos com maior número de padrões analíticos disponíveis no laboratório: as sulfonamidas. O desenvolvimento foi feito, então, de modo a obter-se uma separação de todos os analitos desta classe ajustando-se, em seguida, o método para o restante dos padrões de produtos veterinários disponíveis.
Após uma pesquisa na literatura sobre o tipo de fase móvel comumente empregada para esta classe de compostos, optou-se pelo uso de ácido fórmico 0,1% em água milli-Q, como solvente aquoso (solvente A) e testou-se o uso de metanol (MeOH) ou acetonitrila (ACN) como solvente orgânico (solvente B).
Para a avaliação destes solventes como fase móvel, foram injetados dez compostos, na concentração 1mg/L (sulfatiazol, sulfacetamida, sulfadizina, sulfamerazina, sulfametizol, sulfaquinoxalina, sulfametazina, sulfametoxazol, sulfaclorpiridazina, sulfadimetoxina), em um HPLC-UV, coluna C18, nas seguintes
condições: fluxo = 0,25 mL/min; temperatura da coluna = 40oC; comprimento de onda = 270 nm, eluição isocrática (90% A, 10% B).
Os cromatogramas obtidos para estes testes iniciais são apresentados nas Figuras 18 e 19. A partir destes cromatogramas, pode-se observar que o uso de MeOH resultou em picos com pouca simetria, com fronting altamente pronunciado, além de maior tempo para eluição do último composto (38 minutos, contra 30 minutos com o uso de ACN).
69 Figura 18: Cromatograma referente à eluição isocrática das sulfonamidas, com uso de ACN como
solvente orgânico.
Figura 19: Cromatograma referente à eluição isocrática das sulfonamidas, com uso de MeOH como solvente orgânico.
Depois de definida a fase móvel – ácido fórmico 0,1% em água (A) e ACN (B) – a próxima etapa do desenvolvimento do método cromatográfico foi ajustar um gradiente para promover a separação das sobreposições de picos observadas em 4, 9 e 12 minutos e, também, para diminuir o tempo de retenção do último compostos eluído, diminuindo o tempo de corrida.
Para resolver o primeiro problema – a sobreposição de picos no início da corrida – diminuiu-se a porcentagem inicial de solvente orgânico para de 10% para
ACN 10% Ac. Form. 90%
MeOH 10% Ac. Form. 90%
70 5% para, deste modo, diminuir a afinidade dos compostos com a fase móvel, aumentando a retenção destes na coluna.
Para diminuir o tempo de retenção dos últimos compostos eluídos, aumentou- se gradativamente a porcentagem de solvente orgânico, de 5% no início da corrida para 50% em 40 minutos. Esse gradiente de concentração mostrou-se eficiente na separação dos dez compostos analisados. Em seguida, cada sulfonamida foi injetada separadamente, para determinar a ordem de eluição e o tempo de retenção de cada uma.
A Figura 20 mostra os dez cromatogramas (sobrepostos) referentes à injeção individual de cada sulfonamida com o gradiente de concentração otimizado.
Com a separação das sulfonamidas determinada, seguiu-se a próxima etapa do desenvolvimento cromatográfico, que consistiu em adicionar à corrida, com as condições estabelecidas com as sulfas, o restante dos padrões analíticos de produtos veterinários disponíveis no laboratório. Cada composto foi injetado individualmente, para determinação do tempo de retenção no gradiente empregado. Os tempos de retenção de todos os compostos avaliados nesta etapa são apresentados na Tabela 11.
Figura 20: Cromatogramas referentes à injeção individual de cada sulfonamida para determinação da
71 Tabela 11: Compostos analisados por HPLC-UV
Composto Tempo de Retenção (min)
Sulfacetamida 7,2 Sulfadiazina 8,6 Sulfatiazol 10,2 Sulfamerazina 11,7 Trimethoprim 12,9 Cefalexina 12,9 Norfloxacina 14,1 Sulfametazina 14,4 Sulfametizol 14,4 Furazolidona 15,5 Enrofloxacina 16,3 Sulfaclorpiridazina 17,8 Sulfametoxazol 19,6 Clorfenicol 23,8 Ceftiofur 24,4 Sulfadimetoxina 24,8 Sulfaquinoxalina 25,1 Albendazol 28,5 Tilosina 30,2 Fembendazol 34,9 Flunixina Meglumina 36,9
Os compostos apresentados na Tabela 11 foram os possíveis de serem analisados no comprimento de onda 270 nm.
Além destes, outros nove padrões analíticos de produtos veterinários se encontravam disponíveis no laboratório; entretanto estes analitos não apresentaram absorção neste comprimento de onda. Estes compostos são: neomicina, eritromicina, levamizol, florfenicol, fenilbutazona, fipronil e estreptomicina.
Foram feitas injeções individuais com estes compostos, nas mesmas condições, no comprimento de onda = 215 nm. No entanto, nenhuma dessas injeções foi bem sucedida, apresentando perfis como o observado no cromatograma apresentado na Figura 21, representando a injeção de eritromicina no comprimento de onda 270 nm (em preto) e 215 nm (em rosa).
72 Figura 21: Cromatograma referente à injeção individual de eritromicina nos comprimentos de onda de
270 e 215 nm.
A existência de diversos picos, que não podem ser totalmente observados no cromatograma; devido à escala, dificulta a identificação precisa do pico do analito. Vários picos também foram observados nos cromatogramas dos outros analitos, assim como no cromatograma da injeção somente de solvente, porém não no mesmo tempo de retenção e não com a mesma intensidade, tornando impossível a identificação do tempo de retenção dos compostos.
Além da existência de mais de um pico em todas as injeções, o comportamento da linha de base dificulta a avaliação do cromatograma. Desta forma, não foi possível a identificação do tempo de retenção destes compostos no HPLC-UV, deixando-se esta identificação para ser feita na próxima etapa do trabalho, com o uso de um LC-MS/MS.
A Figura 22 apresenta um cromatograma referente à separação, nas condições finais estabelecidas para a corrida cromatográfica (Tabela 7 e Figura 12), dos compostos: sulfadiazina, sulfatiazol, sulfamerazina, trimethoprim, sulfametazina,
73 Figura 22: Cromatograma referente à separação dos compostos: sulfadiazina (SDA),
sulfatiazol (STZ), sulfamerazina (SMR), trimethoprim (TRI), sulfametazina (SMT), enrofloxacina (ENR), sulfaclorpiridazina (SCL), sulfametoxazol (SMX), clorfenicol (CLF),
ceftiofur (CEF), sulfaquinoxalina (SQX), albendazol (ALB), tilosina (TIL), fembendazol (FEM), flunixina meglumina (FLM).
enrofloxacina, sulfaclorpiridazina, sulfametoxazol, clorfenicol, ceftiofur, sulfaquinoxalina, albendazol, tilosina, fembendazol, flunixina meglumina. Alguns compostos presentes na Tabela 11, não estão presentes neste cromatograma devido à sobreposição de picos.
Essa separação foi considerada satisfatória, ou seja, foi cumprido o objetivo desta etapa, que era estabelecer uma condição cromatográfica que possibilitasse a separação de um maior número de compostos com uma única injeção.