4.4.5 – OUTROS MATERIAS UTILIZADOS NOS ENSAIOS:

MATERIAL E MÉTODOS

4.4.5 – OUTROS MATERIAS UTILIZADOS NOS ENSAIOS:

Autoclave Balança de precisão Centrífuga Jarra de anaerobiose Balança eletrônica Frascos Erlenmeyer 100 ml e 500 ml Alça Drigaski Espátula nº24

Estufa ajustada para 37ºC Pipeta de 1 ml, 5ml e 10 ml Tubos de ensaio

Placas de Petri estéreis Água deionizada

FIGURA 1- DENTIFRÍCIOS

FIGURA 2- HIDRÓXIDO DE CÁLCIO P.A .

4.4.6 MÉTODOS

Para o preparo das soluções foram utilizados 10ml de água deionizada estéril para 3 gramas de cada amostra de dentifrício e 1 grama de hidróxido de cálcio P. A para 1 ml de água deionizada em tubos estéreis.

FIGURA 3 – 3 GRAMAS DE CADA AMOSTRA DE DENTIFRÍCIO E 1 GRAMA DE HIDRÓXIDO DE CÁLCIO P.A .

Em seguida, a mistura foi vigorosamente agitada por 30 segundos em um homogeinizador. As suspensões resultantes de cada amostra foram então centrifugadas em centrífuga a 6000 RPM durante 15 minutos para precipitar as partículas sólidas dos dentifrícios. Logo após, foram retirados 5 ml do sobrenadante concentrado de cada extrato aquoso das amostras dos dentifrícios. Com este volume foi iniciada uma seqüência de diluições seriadas na razão de 1:2 preparadas com 5 ml de água deionizada pura até a proporção de 1:32.

FIGURA 5 – SUSPENSÕES HOMOGEINIZADAS

FIGURA 6 – SUSPENSÕES CENTRIFUGADAS

Foram obtidas culturas recentes desses microrganismos através da inoculação em 5 ml de meio de cultura com incubação a 37ºC, por 72 horas em condições de microaerofilia pela técnica da vela e de anaerobiose através de envelopes geradores de anaerobiose (OXOID). Após o período de incubação foi feita uma padronização da cultura (0,5 da escala de Mc Farland) para utilização como inóculo teste.

As placas de Petri com ágar Mueller Hinton foram inoculadas com 0,1 ml de cultura de cada microrganismo com auxílio da alça Drigaski e após a absorção foi adicionado 10 ml de sobrenadante concentrado dos dentifrícios em questão as quais as diluições são 1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 do sobrenadante concentrado do dentifrício.Os testes foram realizados em duplicata em microaerofilia e na anaerobiose. Como controle negativo foi utilizado 10 ml de água destilada, além de hidróxido de cálcio PA na forma de suspensão e solução.

FIGURA 7- PLACA DE PETRI COM ÁGAR MUELLER HINTON INOCULADAS COM 0,1 ML DE CULTURA DE CADA MICRORGANISMO COM AUXÍLIO DA ALÇA DE DRIGASKI

Foram utilizadas 20 placas de Petri para cada microrganismo(20 para Actinomyces viscosus, sendo 10 placas na microaerofila e 10 placas na anaerobiose; 20 para Streptococus mutans, sendo 10 placas na microaerofila e 10 placas na anaerobiose; 20 para Streptococus sobrinus, sendo 10 placas na microaerofila e 10 placas na anaerobiose e 20 para Lactobacillus acidophilus, sendo 10 placas na microaerofila e 10 placas na anaerobiose; totalizando a utilização de 80 placas.

FIGURA 8- JARRA DE MICROAERO- FIGURA 9- JARRA DE ANAERO- BIOSE BIOSE

Após o período de incubação a leitura foi realizada verificando-se a ausência ou presença de halo de inibição. Os halos de inibição do crescimento bacteriano foram lidos por dois observadores, devidamente calibrado e experiente em medições para o teste da concentração inibitória mínima.

FIGURA 10 – HALO DE INIBIÇÃO DO STREPTOCOCUS MUTANS NA ANAEROBIOSE

FIGURA 11 – HALO DE INIBIÇÃO DO STREPTOCOCCUS SOBRINUS NA ANAEROBIOSE

FIGURA 12 – HALO DE INIBIÇÃO DO ACTINOMYCES VISCOSUS NA MICROAEROFILIA

FIGURA 13 – AUSÊNCIA DE HALO DE INIBIÇÃO DO LACTOBACILLUS ACIDOPHILUS NA MICROAEROFILIA

RESULTADOS

5. RESULTADOS

Os resultados referentes aos testes de atividade antimicrobiana com dentifrícios e hidróxido de cálcio estão mostrados nas tabelas a seguir.

Nas tabelas estão representados os halos de inibição do crescimento bacteriano referentes aos dentifrícios e hidróxido de cálcio nas seguintes concentrações: sobrenadante concentrado, diluição 1:2, diluição 1:4, diluição 1:8, diluição 1:16 e diluição 1:32.

Na tabela 1 pode ser observado que houve halos de inibição do crescimento bacteriano de Streptococcus mutans na microaerofilia no concentrado do sobrenadante (sem diluição) dos dentifrícios:Close up,Sorriso e Colgate; nas diluições 1:2 e 1:4 do dentifrício Colgate.

Na tabela 2 pode ser observado que houve halos de inibição do crescimento bacteriano do Streptococcus sobrinus na microaerofilia no concentrado do sobrenadante(sem diluição) nos dentifrícios: Close up, Sorriso e Colgate; nas diluições 1:2 e 1:4 do dentifrício Colgate.

Na tabela 3 houve halos de inibição do crescimento bacteriano do Lactobacillus acidophilus na microaerofilia no concentrado(sem diluição), diluição 1:2 nos dentifrícios Close up e Colgate e a diluição 1:4 no dentifrício Colgate e no dentifrício Sorriso não houve halo de inibição.

Na tabela 4 houve halos de inibição do crescimento bacteriano do Actinomyces viscosus na microaerofilia no concentrado do sobrenadante (sem diluição) nos dentifrícios: Close up, Sorriso e Colgate; nas diluições 1:2 os dentifrícios Sorriso e Colgate e 1:4 o dentifrício Colgate.

Na tabela 5,6 e7 pode ser observado que houve halos de inibição do crescimento bacteriano do Streptococcus mutans(tabela 5), Streptococcus sobrinus(tabela6) e Actinomyces viscosus (tabela 7)na anaerobiose no concentrado do sobrenadante (sem diluição) nos dentifrícios: Close up, Sorriso e Colgate; nas diluições 1:2 o dentifrício Colgate.

Na tabela 8 pode ser observado que houve halos de inibição do crescimento do Lactobacillus acidophilus na anaerobiose na diluição 1:2 os dentifrícios Close up e Colgate e na “sem diluição”

Os testes estatísticos foram aplicados até as diluições 1:4, pois as diluições 1:8, 1:16 e 1:32 não houve formação de halo de inibição em relação aos microrganismos utilizados.

Tabela 1- Halo de inibição do crescimento bacteriano do Streptococus mutans referente às diluições dos dentifrícios e HPA na microaerofilia

Halo de inibição do Streptococcus mutans na microaerofilia Diluição Material s / diluição 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 Controle - - - - - - Sol. Ca(OH)2 - - - - - - Susp.Ca(OH)2 - - - - - - Close up + - - - - - Sorriso + - - - - - Colgate + + + - - -

Tabela 2- Halo de inibição do crescimento bacteriano do Streptococus sobrinus referente às diluições dos dentifrícios e HPA na microaerofilia

Halo de inibição do Streptococcus sobrinus na microaerofilia diluição material s / diluição 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 controle - - - - - - Sol. Ca(OH)2 - - - - - - Susp.Ca(OH)2 - - - - - - Close up + - - - - - Sorriso + - - - - - Colgate + + + - - - + halo de inibição - halo de inibição

Tabela 3- Halo de inibição do crescimento bacteriano do Lactobacillus acidophilus referente às diluições dos dentifrícios e HPA na microaerofilia

Halo de inibição do Lactobacillus acidophilus na microaerofilia diluição material s / diluição 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 controle - - - - - - Sol.Ca(OH)2 - - - - - - Susp.Ca(OH)2 - - - - - - Close up + + - - - - Sorriso - - - - - - Colgate + + + - - -

Tabela 4- Halo de inibição do crescimento bacteriano do Actinomyces viscosus referente às diluições dos dentifrícios e HPA na microaerofilia

Halo de inibição do Actinomyces viscosus na microaerofilia diluição material s / diluição 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 controle - - - - - - Sol.Ca(OH)2 - - - - - - Susp.Ca(OH)2 - - - - - - Close up + - - - - - Sorriso + + - - - - Colgate + + + - - -

Tabela 5- Halo de inibição do crescimento bacteriano do Streptococus mutans referente às diluições dos dentifrícios e HPA na anaerobiose

Halo de inibição do Streptococcus mutans na anaerobiose diluição material s / diluição 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 controle - - - - - - Sol.Ca(OH)2 - - - - - - Susp.Ca(OH)2 - - - - - - Close up + - - - - - Sorriso + - - - - - Colgate + + - - - -

Tabela 6- Halo de inibição do crescimento bacteriano do Streptococus sobrinus referente às diluições dos dentifrícios e HPA na anaerobiose

Halo de inibição do Streptococcus sobrinus na anaerobiose diluição material s / diluição 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 controle - - - - - - Sol.Ca(OH)2 - - - - - - Susp.Ca(OH)2 - - - - - - Close up + - - - - - Sorriso + - - - - - Colgate + + - - - -

Tabela 7- Halo de inibição do crescimento bacteriano do Actinomyces viscosus referente às diluições dos dentifrícios e HPA na anaerobiose

Halo de inibição Actinomyces viscosus na anaerobiose diluição material _{s / diluição 1:2} _1:4 _1:8 _1:16 _1:32 controle - - - - - - Sol.Ca(OH)2 - - - - - - Susp.Ca(OH)2 - - - - - - Close up + - - - - - Sorriso + - - - - - Colgate + + - - - -

Tabela 8- Halo de inibição do crescimento bacteriano do Lactobacillus acidophilus referente às diluições dos dentifrícios e HPA na anaerobiose

Halo de inibição do Lactobacillus acidophilus na anaerobiose diluição material s / diluição 1:2 1:4 1:8 1:16 1:32 controle - - - - - - Sol.Ca(OH)2 - - - - - - Susp.Ca(OH)2 - - - - - - Close up + + - - - - Sorriso - - - - - - Colgate + + - - - -

MICROAEROFILIA

O grupo controle (água destilada) e do Hidróxido de cálcio apresentaram os mesmos resultados, sem atividade antimicrobiana e não mostraram diferenças significativas em relação aos grupos de dentifrícios Close-up e Sorriso (p=0,22), entretanto o grupo do dentifrício Colgate mostrou uma diferença significativa em relação aos grupos de dentifrícios Close-up e Sorriso (p=0.03) e uma diferença altamente significativa em relação ao grupo controle e do Hidróxido de cálcio (p=0,001), para S. mutans e S. sobrinus.

Para Lactobacillus acidophilus, o grupo controle, hidróxido de cálcio e Sorriso apresentaram-se de forma idêntica, sem atividade antimicrobiana, e o grupo do Close-up diferença apresentou uma atividade antimicrobiana significativa em relação a eles (p=0,03); a atividade antimicrobiana do Colse-up e Colgate não mostraram diferenças significativas (p=0,22) e assim como para S. mutans e S. sobrinus, Colgate apresentou uma diferença altamente significativa em relação ao grupo controle, Hidróxido de cálcio e Sorriso (p=0,001).

Já para Actinomyces viscosus, grupo controle e Hidróxido de cálcio apresentaram os mesmos resultados, sem atividade antimicrobiana e não mostraram diferença significativa em relação ao Close-up (p=0,22), uma diferença significativa em relação ao Sorriso e uma diferença altamente significativa em relação ao Colgate (p=0,001), e o grupo Sorriso e Colgate não apresentaram diferença significativa entre si (p=0,22)

ANAEROBIOSE

O grupo controle (água destilada) e do Hidróxido de cálcio apresentaram os mesmos resultados, sem atividade antimicrobiana e não mostraram diferenças significativas em relação aos grupos de dentifrícios Close-up e Sorriso (p=0,22), entretanto o grupo do dentifrício Colgate mostrou uma diferença significativa em relação ao grupo controle (p=0.03), e não apresentou diferença siginificativa em

relação aos grupos Close-up e Sorriso (p=0,28), para S. mutans, S. sobrinus e Actinomyces viscosus.

O grupo controle, hidróxido de cálcio e Sorriso apresentaram-se de forma idêntica, sem atividade antimicrobiana, e o grupo do Close-up e Colgate apresentaram a mesma atividade antimicrobiana,apresentando uma diferença significativa em relação aos demais (p=0,03) no Lactobacillus acidophilus.

DISCUSSÃO

6. DISCUSSÃO

Tem sido observado universalmente que os dentifrícios fluoretados desempenham papel preponderante na reduçäo da prevalência de cárie. Isto é particularmente válido nos países industrializados, onde o efeito foi constatado de maneira nítida, a partir da introduçäo dos produtos nos respectivos mercados. O mecanismo de açäo cariostática está relacionado com a formaçäo de fluoreto de cálcio que se deposita sobre o esmalte dentário, independentemente do ingrediente ativo contido nas pastas. Este composto se comporta como reservatório de íons flúor, liberados durante os ciclos de pH na placa dental, os quais participam ativamente nos processos de des-remineralizaçäo. O efeito será potencializado quando houver adequada higiene bucal( CRUZ, 1993).

O triclosan é um agente não iônico que possui amplo espectro antimicrobiano, com atividade contra bactérias Gram-positivas, Gram-negativas e fungos. Pode ser encontrado para o uso odontológico, como integrante de colutórios ou dentifrícios (THYLSTRUP & FEJERSKOV,1994).

É importante lembrar que os microrganismos foram testados isoladamente in vitro, isto é, fora de seu meio natural e alterando consideravelmente seu modo de atuação, principalmente em função da ausência da saliva.

Os microrganismos testados(Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Actinomyces viscosus e Lactobacillus acidophillus)foram selecionados pela sua significativa participação no processo da cárie dentária(NEWBRUM, 1988).

Os resultados obtidos neste estudo revelaram que todos os dentifrícios fluoretados testados in vitro tiveram ação antibacteriana e o hidróxido de cálcio PA testado in vitro não demonstrou ação antibacteriana.

Analisando os resultados encontrados observamos que o sobrenadante concentrado de todos os dentifrícios inibiram em todas as espécies.Na microaerofilia e na anaerobiose determinaram inibição para Streptococcus mutans e Streptococcus sobrinus todos os dentifrícios testados (Close up, Sorriso e

Colgate). Já na microaerofilia e anaerobiose determinaram inibição para Lactobacillus acidophilus os dentifrícios:Close up e Colgate. O dentifrício Sorriso não apresentou inibição para Lactobacillus acidophillus na microaerofilia e na anaerobiose.

O dentifrício que apresentava o triclosan como substância ativa, quando comparado aos demais, revelou resultados melhores à inibição de Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus acidophilus e Actinomyces viscosus.Quando foi realizada uma somatória das diferentes inibições conseguidas para cada microrganismo, encontramos que o dentifrício contendo triclosan era o de maior nível inibitório. Entretanto, os outros dois dentifrícios que não possuem triclosan e também determinaram uma inibição microbiana relevante, mostrando que esta substância não é absoluta em relação à inibição microbiana.

O hidróxido de cálcio é bastante utilizado na odontologia, devido à sua propriedade de estimular a formação de dentina esclerosada, reparadora e proteger a polpa contra os estímulos termelétricos e ação antibacteriana. A indução ou auxílio na neoformação dentinária parece ser decorrente do pH altamente alcalino e de sua atividade antibacteriana (MONDELLI,1998).

Já o hidróxido de cálcio PA testado em nosso trabalho não apresentou atividade antimicrobiana na forma de solução e suspensão frente a todos os microrganismos testados.

SILVA (1997) avaliou a capacidade inibitória mínima de três dentifrícios "in vitro" sobre componentes da microbiota oral envolvidos nos processos de cárie e gengivite marginal. Os resultados demonstraram que o dentifrício que continha triclosan comportou-se com maior regularidade do que os demais, revelando melhor efeito inibitório. .Este fato foi demonstrado em nosso trabalho, pois o dentifrício que continha triclosan foi mais eficiente frente a todos os microrganismos testados.

Nossos estudos atestam pelos resultados que todos os dentifrícios estudados possuem atividade antimicrobiana, mas o dentifrício que continha triclosan foi mais efetivo em relação aos outros estudados, tanto é verdade que

GAETTI JARDIM JÚNIOR et al (1998) avaliaram in vitro a atividade antimicrobiana de onze dentifrícios e verificaram que todos os dentifrícios possuem atividade antimicrobiana, mas os que se mostraram mais eficazes possuíam triclosan em sua composiçäo.

PACAGNELLA et al (1999) determinaram a diluição inibitória máxima (DIM) / concentração inibitória mínima (CIM) de 21 dentifrícios disponíveis no mercado nacional, frente a diferentes microrganismos indicadores (bactérias Gram- positivas, Gram-negativas e leveduras) Os resultados demonstraram que todas as formulações de dentifrícios testadas exerceram atividade antimicrobiana contra bactérias Gram-positivas. Os dentifrícios que contêm triclosan em sua fórmula apresentaram atividade contra bactérias Gram-positivas, gram-negativas e leveduras.Esses resultados estão de acordo com os nossos, em que o dentifrício que contêm triclosan foi o que melhor teve atividade antimicrobiana.

VELMOVITSKY (2001) avaliou a capacidade inibitória mínima in vitro de 25 dentifrícios encontrados no mercado nacional sobre microrganismos envolvidos no processo de cárie e analisada a participação de várias substâncias destes dentifrícios no processo de inibição microbiana. Concluiu-se que os dentifrícios que contêm triclosan apresentam-se sempre com potencial para inibição de microrganismos cariogênicos. Estes resultados vêm de encontro, também, com os nossos achados, onde o dentifrício que apresentava triclosan apresentou um resultado melhor a inibições de Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Lactobacillus acidophilus e Actinomyces viscosus

SPERANÇA et al.(1985) avaliaram o efeito antibacteriano da água de hidróxido de cálcio através do teste de difusão em ágar contra várias espécies microbianas nos tempos de 1, 5, 10 e 15 minutos. Os resultados mostraram uma atividade antibacteriana extremamente baixa da solução testada.

MARQUES et al (1992) testaram "in vitro" da açäo antimicrobiana do hidróxido de cálcio na forma pastosa e em soluçäo em contato direto com as cepas microbianas. Na forma de soluçäo, o efeito somente foi observado quando em concentrações elevadas, enquanto que na forma pastosa a açäo antimicrobiana ficou vinculada à superfície de contato com as cepas testadas.

CONCLUSÕES

7. CONCLUSÕES

Mediante os resultados obtidos no presente trabalho, pode-se concluir que:

1. Todos os dentifrícios no presente trabalho são fluoretados e revelaram ação inibitória frente aos microrganismos

(Streptococcus mutans, Streptococcus sobrinus, Actinomyces viscosus e Lactobacillus acidophilus) presente na lesão de cárie.

2. Os dentifrícios tiveram o mesmo comportamento no sobrenadante concentrado e diferentes comportamento nas diluições pesquisadas.

3. O dentifrício Colgate apresentou-se com maior potencial para inibição de microrganismos cariogênicos.

4. O hidróxido de cálcio PA na forma de solução e suspensão utilizado neste trabalho não revelou ação inibitória para os quatro microrganismos presente na lesão de cárie.

No documento JULIANA GARCIA MUGNAI VIEIRA SOUZA (páginas 52-73)