Oxidação Anaeróbia da Amônia (Processo Anammox)

Até a última década do século XX, apenas processos de oxidação aeróbia do nitrogênio amoniacal seguido de desnitrificação (redução dos óxidos de nitrogênio) eram discutidos

como alternativa de remoção do nitrogênio de águas residuárias. Desde 1994, com a ocorrência de um fenômeno diferente do processo convencional de remoção biológica da amônia, observado por Mulder e outros (1995), o setor de saneamento ambiental, quanto a remoção biológica de nitrogênio, tem passado por grandes evoluções, investido e estimulado mais pesquisas voltadas ao saneamento com menor consumo de energia. A ocorrência desse fenômeno, que consistiu na remoção biológica de amônio sob condições anóxicas, chamou a atenção dos pesquisadores sobre a existência de um processo biológico de remoção de nitrogênio amoniacal (NH3 e/ou NH4+) até o momento desconhecido. Após descoberta, esse processo ficou conhecido como Anammox – Anaerobic Ammonium Oxidation (Oxidação Anaeróbia da Amônia).

Mulder et al. (1995), operando um reator desnitrificante de leito fluidizado, aplicado ao tratamento de efluente de um reator metanogênico que tratava resíduos de uma fábrica de produção de fermento, em Delft na Holanda, observaram que amônio e nitrato eram consumidos concomitantemente no sistema, resultando em elevada produção de gás nitrogênio. Após 420 dias de operação uma taxa máxima de remoção de amônio de 0,4kg N- NH4+.m-3.d-1 foi observada. Estudos demonstraram que o NO3- era o aceptor de elétrons utilizado na reação, que oxidava o íon amônio a nitrogênio molecular sob condições anóxicas. A estequiometria da reação (Equação 15), a partir do NO3- como aceptor de elétrons, foi definida e o processo denominado de Anaerobic Ammonium Oxidation – Anammox.

+ − +_{+ → + +} H O H N NO NH 3 4 9 2 5 4 3 2 2 (∆G° = -297 kJ.mol -1 ) (15)

A existência de organismos capazes de oxidar amônia a nitrogênio gasoso com NO3- como aceptor de elétrons e CO2 como doador de elétrons, já havia sido postulada em 1977 por Broda (1977) citado por Mulder et al (1995), com base em cálculos termodinâmicos. Entretanto, até 1995 a existência desses microrganismos nunca havia sido demonstrada. Estudos sobre esse novo processo, realizados ainda com população microbiana mista e não identificada em reator de leito fluidizado, indicaram que a reação Anammox também poderia ser conduzida com o nitrito (NO2-) como aceptor de elétrons, segundo Equação (16)(van de GRAAF et al., 1995). O H N NO NH₄++ ₂− → ₂+2 ₂ (∆G° = -358 kJ.mol-1) (16)

van de Graaf et al. (1995), provaram que o processo Anammox é realmente mediado por bactérias. Experimentos em bateladas foram conduzidos sob condições anóxicas em reatores contendo apenas água residuária (sem inóculo) ou água residuária mais o lodo utilizado por Mulder et al. (1995). Nos reatores com inóculo, 110mg NH3/L foram oxidadas em 9 dias. Já nos reatores sem inóculo o processo não ocorreu.

O princípio da Anaerobic Ammonium Oxidation consiste na conversão autotrófica do N- amoniacal a nitrogênio gasoso (N2), com o NO2- ou NO3- como aceptor de elétrons. O processo ocorre em condições anóxicas e utiliza carbono inorgânico como fonte de produção de material celular. Vale ressaltar que a oxidação da amônia ocorre simultaneamente à redução do aceptor de elétrons. Muitos estudos que envolvem esse processo utilizam o NO2- como o aceptor de elétrons (STROUS et al., 1999a; JETTEN et al., 1999; STROUS, 2000; MARTINS, 2007). Energeticamente a oxidação do NH4+ com o NO2- para produção de N2 é mais favorável (Equação 16, ∆G° = -358 kJ.mol-1) do que utilizando o NO3- (Equação 15, ∆G° = -297 kJ.mol-1).

Comparando-se o processo Anammox com o processo convencional de remoção biológica de nitrogênio amoniacal, nitrificação autotrófica-desnitrificação heterotrófica, algumas vantagens podem ser observadas: gás oxigênio e carbono orgânico não são requeridos como fonte de energia e carbono, respectivamente, e gás nitrogênio é obtido por rota mais curta (Figura 7).

Figura 7 - Dois processos biológicos de remoção de nitrogênio: Nitrificação-Denistrificação e Anammox.

Fonte - adaptado de PAQUES, 2010.

Na Tabela 3 estão evidenciados alguns parâmetros operacionais desses processos. Fica clara a baixa afinidade (ks) e a lenta duplicação dos microrganismos Anammox quando comparado a nitrificação convencional (NETO, 2007).

Tabela 3 - Comparação entre os processos Nitrificação – Desnitrificação convencional e Anammox e, parâmetros para oxidação aeróbia e anaeróbia da amônia.

Parâmetros Nitrificação Desnitrificação Anammox

Bactérias Autotróficas Heterotróficas Autotróficas

Estágios 02 01 01

Condições Óxica Anóxica Anóxica

Consumo de O2 (mg O2. mgN -1 ) 4,6 Nenhum Nenhum Produto final NO3- N2 N2 pH 7,5 – 8,5 7,2 – 8,0 6,5 – 8,5 (ótimo 7,0 a 7,5) 6,7 – 8,3 (ótimo 8,0) T (°C) 25,0 ≤ T ≤ 30,0 5,0 ≤ T ≤ 45,0 (ótimo 25,0 ≤ T ≤ 35,0) 20,0 – 43,0 (ótimo 40±3) Número de reatores 01 01 01

Energia livre (kj/mol) -275,0 - -357,0

Rendimento da biomassa (mol/mol.C) 0,08 - 0,07 Velocidade aeróbia (nmol/min/mg proteína) 200,0 – 600,0 - 0,0 Velocidade anaeróbia (nmol/min/mg proteína) 2,0 - 60,0 Velocidade de crescimento (/hora) 0,004 - 0,003

Tempo de duplicação (dias) 0,73 - 10,6

Ks NH4+ (µmol/L) 5,0 – 2600,0 - 5,0

Ks NO2- (µmol/L) - - < 5,0

Ks O2 (µmol/L) 10,0 – 50,0 - -

Fonte - Strous et al., 1999; Jetten et al., 2001; Jetten et al., 2002; Sant’Anna Jr, 2010. Nota: Ks = constante de afinidade.

Vários estudos que auxiliam na caracterização do processo Anammox têm sido realizados, desde a sua descoberta, quanto aos parâmetros operacionais (temperatura, pH, concentração de oxigênio dissolvido, fonte de carbono inorgânico, entre outros), metabolismo bioquímico, substâncias inibitórias e identificação e quantificação dos microrganismos Anammox.

van de Graaf et al. (1996), utilizando biomassa proveniente de reator operado por Mulder et

al. (1995) enriquecida com meio mineral autotrófico, conseguiram aumentar a velocidade de

remoção do nitrogênio como íon amônio de 0,4kg N.m-3.d-1 para 2,4kg N.m-3.d-1. O meio sintético era constituído basicamente de NH4+, NO2- e carbonato como doador de elétrons, aceptor de elétrons e fonte de carbono, respectivamente. A concentração de oxigênio dissolvido foi mantida abaixo dos limites de detecção (<1,0µM) para prevenir efeitos inibitórios.

Em outro estudo, partindo do mesmo inóculo, van de Graaf et al. (1997) estudaram a oxidação anaeróbia da amônia utilizando 15N radiotivamente marcado. Hidroxilamina (NH2OH) e hidrazina (N2H4+) foram identificados como importantes compostos intermediários da reação. A Figura 8 demonstra esquematicamente como a hidroxilamina e hidrazina são formadas.

Figura 8 - Possível rota metabólica para o processo Anammox.

Fonte - adaptado de van de Graaf et al., 1997.

As bactérias obtidas de cultivos enriquecidos apresentam um compartimento formado por membranas, denominado anammoxossoma. É no anammoxossoma que ocorre a reação do N- amoniacal com o nitrito e produção do N2 seguido de geração de energia (RATTRAY et al., 2008). Segundo Schmidt et al. (2002), o anammoxossoma pode ocupar cerca de 30% do volume da célula e na sua membrana estão presentes enzimas fundamentais para o processo, como a hidrazina hidrolase e a enzima que catalisa a redução do nitrito no processo Anammox (Figura 9).

Figura 9 - Representação de possível modelo para as transformações bioquímicas ocorridas no processo Anammox. (a) Representação celular simplificada do organismo. (b) A membrana no anammoxossoma.

Fonte - adaptado de Ahn Y-H, 2006.

Os intermediários reacionais hidroxilamina (NH2OH) e a hidrazina (N2H4) são importantíssimos para a promoção do processo Anammox. A hidrazina atua como doador de elétrons para a conversão do NO2- a hidroxilamina (Figura 8 e Figura 9). A enzima hidrazina

hidrolase catalisa a reação de formação da hidrazina, que é oxidada a nitrogênio molecular pela enzima hidroxilamina oxido-redutase. A enzima nitrito redutase catalisa a redução do nitrito a hidroxilamina.

A partir desta suposta rota metabólica Strous et al. (1998), trabalhando em reator em batelada sequencial com uma eficiente retenção de biomassa (>90%), postularam a reação global que governa o processo Anammox (Equação 17) a partir do NO2- como aceptor de elétrons. O principal produto da reação é o N2, porém cerca de 10% do nitrogênio alimentado é convertido a nitrato (AHN Y-H, 2006). Além da determinação de parâmetros estequiométricos da reação, outros parâmetros, também importantes, foram determinados (STROUS et al., 1998): rendimento da biomassa (0,066 ± 0,01 molC.(mol.NH4+)-1); máxima velocidade específica de consumo de NH4+ (45 ± 5 nmol.min-1.(mg.proteína)-1); e, a máxima velocidade específica de crescimento (0,0027h-1, com tempo de duplicação de aproximadamente 11 dias). O H N O CH NO N H HCO NO NH 2 15 , 0 5 , 0 2 3 2 3 2 4 03 , 2 066 , 0 26 , 0 02 , 1 13 , 0 066 , 0 32 , 1 1 + + + → + + + − − + − + (17)

De acordo com Strous et al. (1998), para o estabelecimento da reação Anammox 1,32 moles de NO2- são necessários para oxidar 1 mol de NH4+, diferente da reação estequiométrica estimada por van de Graff et al. (1995). Essa proporção de 1:1,32 de NH4+ e NO2- está relacionada com a conversão biológica de parte do nitrito a nitrato durante a fixação do carbono inorgânico (observa-se, Equação 18, que 2 moles de NO3- são formados). As bactérias autotróficas requerem um doador de elétrons para fixação do carbono inorgânico. Teoricamente tanto o nitrito (Equação 18) como a amônia (Equação 19) pode ser utilizado como doadores de elétrons, mas na prática, aparentemente, o nitrito é selecionado (van de GRAAF et al., 1996). − −_{+ → +} + 2 2 2 3 2 2NO H O CH O 2NO CO (18) + − +_{+ → + +} + NH H O CH O NO H CO₂ 0,66 ₄ 0,33 _{2 2} 0,66 ₂ 1,32 (19)

A oxidação anaeróbia da amônia é mediada por bactérias quimiolitoautotróficas, pertencentes ao grupo dos Planctomycetes (ordem Planctomycetales) do Domínio Bacteria. Com a evolução da biologia molecular, técnicas moleculares como hibridação in situ fluorescente

(FISH, do inglês fluorescent in situ hybridization), reação em cadeia da polimerase (PCR, Polimerase Chain Reaction) ou análise filogenética têm sido, recentemente, utilizadas como métodos de identificação e quantificação de organismos responsáveis pela rota anóxica de oxidação do nitrogênio (STROUS et al., 2002; TOH, WEBB E ASHBOLT, 2002; DAPENA- MORA et al., 2004; van DE STAR et al., 2007; ARAÚJO et al., 2010). Algumas espécies de bactérias Anammox identificados pela técnica de biologia molecular incluem: Candidatus

Brocadia anammoxidans (STROUS et al., 1999b), Candidatus Brocadia fulgida (KARTAL et al., 2004), Candidatus Scalindua brodae (SCHMIDT et al., 2003a), Candidatus Scalindua wagneri (SCHMIDT et al., 2003a), Candidatus Scalindua sorokinnii (SCHMIDT et al.,

2003b), Candidatus Kuenemia stuttgartiensis (PENTON, DEVOL & TIEDJE, 2006),

Candidatus Jettenia asiatica (Tsushima et al., 2007), Candidatus Anammoxoglobus propionicus (KARTAL, et al., 2007; RATTRAY et al., 2008). Essas bactérias têm sido

encontradas em plantas de tratamento de efluentes e ambientes naturais (Tabela 4).

Tabela 4 - Bactérias Anammox identificadas.

Gênero Espécie Fonte

Brocadia

Candidatus Brocadia anammoxidans (STROUS et al., 1999b)

Efluente, lodo de sistema de lodo ativado Candidatus Brocadia fulgida (KARTAL et al., 2004) Efluente Candidatus Brocadia caroliniensis (MAGRÍ, VANOTTI e

SZOGI, 2010) Efluente animal

Kuenemia Candidatus Kuenemia stuttgartiensis (PENTON, DEVOL

& TIEDJE, 2006) Efluente

Scalindua

Candidatus Scalindua brodae (SCHMID et al., 2003a) Efluente Candidatus Scalindua wagneri (SCHMID et al., 2003a) Efluente Candidatus Scalindua sorokinnii (SCHMID et al., 2003) Mar negro Outras

Candidatus Anammoxoglobus propionicus (KARTAL et

al., 2007; RATTRAY et al., 2008) Efluente Candidatus Jettenia asiatica (Tsushima et al., 2007) Não reportado Fonte - adapatado de Zhang et al., 2008.

As condições ambientais para o estabelecimento do processo Anammox identificadas por STROUS et al. (1999) e STROUS (2000) foram temperatura entre 20 e 43°C, sendo o valor ótimo a 40±3°C, e pH na faixa de 6,7 a 8,3 (com ótimo a pH 8,0). A afinidade entre os microrganismos Anammox e os substratos NH4+ e NO2- foi alta (constante de afinidade menor que 10µM). Concentrações de nitrito acima de 20mM promovem a inibição do processo, apesar que a concentração de 70mg N-NO2-.m-3 (5mM) presente no meio por 12 horas inibiu completamente a atividade Anammox. Sendo a reversibilidade do processo somente alcançada após adição de quantidades traços (±50µM) de hidroxilamina e hidrazina, ambos produtos intermediários do processo (STROUS et al., 1999, STROUS, 2000).

Outros trabalhos concluíram que atividade Anammox, também, é completamente inibida em presença de oxigênio livre, entretanto essa inibição é reversível (STROUS et al., 1997; STROUS et al., 1999; JETTEN et al., 2001). Outros inibidores são: acetileno, cloreto de mercúrio, dinitrofenol e fosfato, esse último por agir como quelante (STROUS et al., 1997). Efeitos inibitórios foram observados por nitrito e fosfato a depender do gênero bacteriano predominante, por exemplo, foi encontrado um limite de inibição da atividade de Candidatus

Borcadia anammoxidans para concentrações de nitrito e fosfato de 98mg N/L e 60mg P/L

(van DE GRAAF et al., 1996; STROUS et al., 1997), enquanto para Candidatus Kuenemia

stuttgartiensis foi de 180mg N/L e 600mg P/L (EGLI et al., 2001; SCHMIDT et al., 2003b).

A reversibilidade do processo Anammox quanto a influência do oxigênio, foi investigada em reator em batelada, com concentração de N-NH4+ e N-NO2- na alimentação de 84mg/L e 112mg/L, respectivamente. Durante 20 dias o sistema foi monitorado para manutenção em ciclos alternados de 2h das condições aeróbia (O2) e anóxica (argônio). Nos períodos sob aeração não foram observados decréscimo do amônio por nitrificação. Efeito contrário foi observado quando a anaerobiose era restabelecida, demonstrando que a inibição foi reversível (STROUS et al., 1997).

A baixa taxa de crescimento dos organismos Anammox (0,0027h-1) limita a aplicação do processo, pois a dificuldade de cultivar e manter grandes quantidades desses microrganismos nos sistemas de tratamento resulta em tempos de partida muito longos e instabilidade operacional. O enriquecimento de consórcios Anammox oriunda de comunidade mista de bactérias requer a otimização e controle das condições que favorecem o processo Anammox em detrimento do crescimento de outros grupos de microrganismos (STROUS et al., 1997; STROUS et al., 1998; DAPENA-MORA et al., 2004; ARAÚJO et al., 2010). Dois reatores largamente citados na literatura para o enriquecimento de consórcios e partida do processo

Anammox (estudos em escala laboratorial) são o Reator em Batelada Sequencial (RBS) e o

reator de leito fluidizado.

O RBS em estudo desenvolvido por Strous et al. (1998) foi favorável ao processo Anammox. 90% de retenção da biomassa foi observada, tornando o reator anaeróbio em batelada sequencial importante aparato para o enriquecimento desses microrganismos. Esse tipo de reator proporciona boa retenção celular (retenção do lodo), favorecendo o crescimento dos organismos responsáveis por mediar a reação Anammox, devido ao longo tempo de geração celular dos mesmos. O RBS permite a distribuição homogênea dos substratos, operação segura por mais de um ano e estabilidade sob condições limitantes de substrato.

O primeiro reator Anammox a operar em escala real teve início em Rotterdam, na Holanda. A empresa que possui a patente (Paques) relata obter sucesso na implantação do processo em escala industrial, inclusive no tratamento de efluentes ricos em N-amoniacal. O reator

Anammox de 70,0 m3, em operação desde 2002, projetado para tratar 500,0 kg N.d-1 (7,1kg N.m-3d-1), é uma unidade (operação unitária) do local onde o lodo da planta de tratamento de efluentes de Dokhaven é tratada. O lodo digerido e centrifugado, que contém cerca de 1200,0 mg N-NH4+/L, é alimentado em reator de nitritação tipo Sharon. O efluente do reator tipo

Sharon serve como afluente do reator Anammox. O efluente do reator Anammox é retornado

para a planta principal de tratamento de efluentes da cidade como afluente (van der Star et al. (2007).

Estudo desenvolvido por van der Star et al. (2007), relatou que o reator Anammox de Rotterdam pode tratar até 750,0 kg N.d-1 (250 kg a mais do que foi projetado). Os primeiros 2 anos de operação foram caracterizados como, períodos de crescimento ou enriquecimento, mas sem detecção de atividade Anammox. Do dia 800 aos 1.250, períodos de aumento da conversão da amônia. Sendo a conversão considerada estável (partida do reator Anammox) 4 anos após o início da operação do reator. A carga máxima projetada (7,1 kg N.m-3.d-1) foi alcançada a partir do dia 1.359. Amostra de lodo desse reator foi coletada para servir de inóculo para novos reatores Anammox, também, instalados na Holanda (Linchtenvoorde e Olburgen). Na Tabela 5, estão listados os locais que utilizaram o processo Anammox em escala piloto e larga escala, bem como o tipo de reator aplicado.

Alguns problemas na partida do reator Anammox (0 – 1.250 dias) que dificultaram a manutenção do aumento da concentração da biomassa Anammox ou atividade, foram discutidos e constatados por van der Star et al. (2007), por exemplo: falha na conversão da amônia devido toxicidade conferida pelo NO2- (alta carga); lavagem da biomassa por conta de mudanças bruscas no regime hidráulico; problemas nas bombas e compressores, dificultando a mistura e carregamento.

Tabela 5 - Conversão de reatores em escala piloto e larga escala para aplicação do processo Anammox. Localização Tipo do reator Volume

(m3) Conversão da áreaa (g N.m-2.d-1) Máx. conversão (kg N.m-3.d-1) Limitação Organismo Rotterdam1 (NL) Reator de lodo granular 70 n.d 10 (20) b Alimentação (NO2-) Brocadia Lichtenvoorde2 (NL) Reator de lodo granular 100 n.d 1 Alimentação (NO2-) Kuenenia Hattingen3c (DE) Leito fluidizado 67 5 1 Na d n.d Mie prefecture4 (JP) Reator de lodo granular 58 n.d 3 Alimentação (NH4 + ) n.d

Balk5 (NL) Reator de lodo

granular 5 n.d 4 Alimentação (NO2 - ) Kuenenia Stockhom6e (SE) Leito fluidizado 2 0,5 0,1 Alimentação (NO2 - ) Brocadia f Zurich7 (CH) RBS 2,5 n.d 2 Alimentação (NO2 - ) n.d Olburgen8 (NL) Colunas de bolhas 600 n.d 1,2 Alimentação Brocadia a

Conversão por área de biofilme. b

Conversão estimada no compartimento inferior. c

Reator 2, quando aeração não foi empregada, e Reator 1 foi operado como um reator de nitritação. d

Mudança de configuração antes da conversão máxima ter sido alcançada. e

Reator foi inicialmente operado como um reator de dois processos nitritração-Anammox, seguido por um reator operando nitritação-Anammox.

f

Reportado por Gut et al. (2006). g

Planta consiste de 4 linhas de 3 RDC’s em séries. Os valores dos primeiros cilindros estão apresentados. h

Reator 1. i

Não reportado, valor estimado baseado na superfície do biofilme de 250 m2.m-3.

j

Organismo foi enriquecido a partir desta fonte (Egli et al., 2001), mas, se esse organismo é dominante é desconhecido. 1

van der Star et AL. (2007); 2 Abma e Haarhuis, pers. comm.; 3 Thöle et al. (2005); 4 Abma e Tokutomi, pers. comm.; 5 van der Star et al. (2007); 6 Gut et al. (2006); 7 Fux et al. (2002); 8 Abma e Haarhuis, pers. comm.

Fonte - adaptado de van der Star, 2007.

4.2.6 Combinação dos Processos de Nitrificação Parcial e Oxidação Anaeróbia da