Pacientes FIdef6 e FIdef7

Estes indivíduos são irmãos e apresentam quadro clínico semelhante, conforme descrito em Materiais e Métodos.

Estes pacientes foram enviados para nosso laboratório com suspeita de deficiência de C3 e, assim que recebemos o material, determinamos as concentrações de diferentes proteínas do SC em seu soro (Tabela 10), assim como avaliamos a atividade hemolítica dependente das vias alternativa e clássica do SC.

Tabela 10 – Concentração de diferentes proteínas do SC no soro dos pacientes FIdef6 e FIdef7 por Mancini e ensaio hemolítico realizado em tubos.

Indivíduos C3 (µg/ml) Fator B (µg/ml) Fator I (µg/ml) Fator H (µg/ml) AP50 (U/ml) CH50 (U/ml) FIdef6 262,2 <28,5 Indetectável 214 0 0 FIdef7 289,6 <28,5 Indetectável 244,6 0 0 Normal (entre 6- 13 anos de idade) 640-1470 * 228,2 * 34-91 # 224-1635 # 106,1±27,1 628,3±130,3

FONTE: * Ferriani et al., 1999; # Ferreira de Paula et al., 2003, Delcolli, 2012.

As concentrações de C3, FB e FI estavam alteradas nos soros dos pacientes FIdef6 e FIdef7, enquanto a concentração de FH apresentava-se com valores dentro da normalidade. A paciente FIdef6 e o paciente FIdef7 apresentavam, respectivamente, a concentração de C3 de 262,2 µg/ml e 289,6 µg/ml, enquanto o esperado em indivíduos com idade entre 06 e 13 anos de idade é de 640 a 1470 µg/ml (Ferriani et al., 1999). Os soros da paciente FIdef6 e do paciente FIdef7 apresentavam a concentração de FB abaixo dos níveis de detecção do ensaio realizado. Os soros da paciente FIdef6 e do paciente FIdef7 apresentavam, respectivamente, a concentração de FH de 214 µg/ml e 244,6 µg/ml enquanto o esperado em indivíduos com idade entre 06 e 13 anos de idade é 224 a 1635 µg/ml (Ferreira de Paula et al., 2003). Os soros da paciente FIdef6 e do paciente FIdef7 apresentavam a concentração FI indetectável em seu soro enquanto o esperado para indivíduos entre 06 e 13 anos de idade é 34 a 91 µg/ml (Ferreira de Paula et al., 2003). Com base nestes resultados podemos concluir que os pacientes em estudo apresentam deficiência primária de FI e deficiência secundária de C3 e

FB em função da ausência/redução de regulação da ativação da alça de amplificação da via alternativa do SC.

Além disso, avaliamos a atividade hemolítica dependente do SC pelas vias alternativa e clássica. Em ambas as situações, os soros dos dois pacientes não apresentaram atividade hemolítica. O esperado de atividade hemolítica dependente da via alternativa do SC é 106,1±27,1 unidades de AP50 e o esperado de atividade hemolítica dependente da via clássica do SC é 628,3±130,3 unidades de CH50, ambos os valores são referência para indivíduos adultos da população brasileira.

O próximo ponto a analisar foi a síntese de RNAm de CFI em fibroblastos desses pacientes através de RT-PCR. Observamos que não houve amplificação de nenhuma região do cDNA, então partimos para a amplificação dos éxons do gene CFI por PCR que foram então enviados para sequenciamento.

Encontramos uma inserção de dois nucleotídeos TA na posição 1382 que causou alteração do quadro de leitura do RNAm de CFI e consequentemente a geração de um códon de parada prematura 13 bases a montante do ponto da inserção (Figura 20). Na Figura 20 apresentamos inicialmente a sequência conforme depositada no GenBank do NCBI e em seguida apresentamos a sequência encontrada nos pacientes FIdef6 e FIdef7. Essa inserção está localizada no éxon 11 do gene CFI, região codificadora de parte dos aminoácidos do domínio de serino protease da proteína madura.

Figura 20 – Trecho da sequência de cDNA de CFI em indivíduos normais e nos pacientes FIdef6 e FIdef7 onde está presente a inserção encontrada, a numeração dos nucleotídeos se fez de acordo com a sequência NM_000204.3 (GenBank).

Em destaque apresenta-se a inserção propriamente dita e o ponto onde ocorre a formação do códon de parada prematura. Os códons nas duas sequências formam destacados utilizando-se grifo e não-grifo, alternadamente.

FONTE: Delcolli, 2012.

Na Figura 21, o eletroferograma obtido confirma a inserção de TA na posição 1382, criando um códon de parada prematura. Além disso, podemos comprovar a inserção de duas bases TA, evidenciada n aFigura 20. As duas sequências apresentadas – do indivíduo normal (A) e do paciente FIdef 7 (B) estão no sentido reverso (3’→ 5’).

Figura 21 – Eletroferogramas originados nas reações de sequenciamento do segmento de CFI referente ao éxon 11 e sua adjacência.

A – Sequência obtida com material de indivíduo normal, idêntica àquela depositada como NM_000204.3 no GenBank. B – Sequência obtida com material do indivíduo FIdef7 (idêntica a do indivíduo FIdef6). Observa-se nitidamente a inserção de duas bases TA nesta região.

FONTE: Delcolli, 2012.

A geração de códon de parada prematura gera RNAm instável e produtos proteicos truncados no interior das células que geralmente são degradados ainda no interior das mesmas. Para avaliar se isso estava acontecendo com esses pacientes analisamos as amostras de soro por Western Blot (Figura 22).

Figura 22 – Western Blot para avaliar a presença de FI no soro dos pacientes FIdef6 e FIdef7 em condições não redutoras.

SHN na diluição 1:10; FIdef6 e FIdef7 – soro dos pacientes na diluição 1:5; FI – proteína FI purificada – 300 ng.

FONTE: Delcolli, 2012.

Podemos observar na Figura 22 que não há banda correspondente à FI com 88 kDa no soro dos pacientes, enquanto a mesma é encontrada no SHN e também no poço apenas com a proteína purificada. Novamente observamos a banda inespecífica de 140 kDa em todas as amostras de soro bruto. Com base nessas figuras pudemos concluir que os pacientes FIdef6 e FIdef7 não secretam a proteína FI em função da presença de um códon de parada prematura em seu RNAm. Embora plausível, não encontramos produtos truncados com tamanho menor que o esperado.

SHN FIdef6 FIdef7 FI

140 kDa

4.3 Análise da expressão gênica dependente de C3 ou FI em fibroblastos de pele utilizando