– PADRÃO DO RITMO SONO/VIGÍLIA

Material e métodos Sujeitos

Foram utilizados 80 ratos Wistar machos, com três a quatro meses de idade (300 – 400 gramas), provenientes do Centro de Desenvolvimento de Modelos Experimentais da UNIFESP (CEDEME). Os animais foram mantidos sob condições controladas de temperatura (23 ± 2°C) e ciclo claro-escuro de 12:12 horas com início da fase clara às 07:00 h. Os animais tiveram livre acesso a água e ração.

Drogas

As drogas utilizadas foram preparadas e administradas da mesma forma que a Etapa 1.

O gaboxadol foi administrado na dose de 1,25mg/kg, pois os animais PS que receberam essa dose, apesar de não diferirem do grupo “PS Vei”, também não diferiram do grupo “CG Vei” quanto ao desempenho no dia do teste.

A dose escolhida para o carbonato de lítio foi de 150mg/kg, por ter revertido o prejuízo de memória dos animais no Experimento 1.

Implante de eletrodos para registro eletroencefalográfico

Para o registro eletroencefalográfico foram confeccionados eletrodos a

revestidos com Teflon^® (California Fine Wire) de 0,008 mm para o registro eletrocorticográfico (ECoG) e de 0,004mm para o registro eletromiográfico (EMG).

Os animais foram pesados e a indução anestésica realizada com xilasina (10mg/kg i.p.) e cetamina (90mg/kg i.p.). Para o implante do eletrodo os animais foram fixados em aparelho estereotáxico (modelo David Kopf) e as coordenadas do local de implante foram seguidas de acordo com Bergmann (1989).

a) 1 mm posterior ao bregma, 3 mm à esquerda da sutura sagital;

b) 3 mm anterior ao bregma, 1 mm à direita da sutura sagital;

c) 1 mm anterior ao lambda, 4 mm à esquerda da sutura sagital;

d) 4 mm anterior ao lambda, 1 mm à direita da sutura sagital.

Para o registro eletromiográfico, um par de eletrodos foi implantado no músculo do pescoço. O implante foi fixado com acrílico odontológico de polimerização rápida e após a cirurgia, os animais receberam 0,5 ml/kg de antibiótico (Pentabiótico^® - Wyeth), intra muscular, para evitar infecção, e 10 mg/kg de antiinflamatório (diclofenaco sódico 25mg/ml) i.m. para indução de analgesia e redução de processos inflamatórios. Após a recuperação anestésica, os animais foram alojados individualmente em gaiolas cúbicas de acrílico transparentes (34 cm de altura x 31,5 cm de largura x 31,5 cm de profundidade) forradas com maravalha. Durante os três dias subseqüentes, algumas gotas de ibuprofeno foram colocadas na água dos animais para completar a ação analgésica e anti-inflamatória.

Registro de sono

O registro de sono dos animais foi realizado em polígrafos digitais Nihon-Kohden^® (modelo QP - 223A), sendo que cada animal foi conectado a 3 canais, dois para o registro do ECoG e o terceiro para o registro do EMG.

O estagiamento dos registros foi realizado pelo programa SleepScorer, dentro do software Matlab^®, em épocas de 10 s (Gross at al., 2009). Os registros de sono foram analisados visualmente pelo experimentador com confirmação pela distribuição das frequências das bandas σ (delta), δ (theta), θ (sigma) e EMG, e a classificação dos estágios do sono foi feita de acordo com Timo-Iaria e cols.

(1970) e Giuditta e cols. (1995), sendo determinados: vigília (V), sono de ondas lentas (SOL), sono paradoxal (SP) e sono de transição (ST). Os filtros utilizados para as bandas δ (delta), θ (theta) e σ (sigma) foram 0,4 - 4 Hz, 5 - 9 Hz e 10 - 14 Hz, respectivamente. Para o estagiamento visual com confirmação da análise espectral das potências das bandas foram utilizados os seguintes critérios: os parâmetros σ x θ e EMG foram utilizados para distinguir a vigília do sono. Épocas com valores de σ x θ abaixo e EMG acima de um limiar estipulado com base na análise visual para cada animal foram consideradas vigília. O parâmetro δ/θ foi utilizado para caracterizar as épocas de SP. Épocas com valores abaixo do limiar δ/θ foram consideradas SP. O ST foi caracterizado por limiares de σ e de δ/θ.

Épocas com valores σ acima do limiar e de δ/θ abaixo foram consideradas ST.

Épocas nas quais não foi possível realizar a identificação foram classificadas como não-identificadas.

Os registros foram analisados durante as 4 h pós-privação de sono, tempo que compreende o período de ação das drogas utilizadas e os parâmetros de comparação utilizados foram:

- Porcentagem de vigília (V), definido por ondas de amplitude baixa, alta frequência de ondas corticais e presença de atividade muscular; a porcentagem foi calculada por tempo de vigília dividido pelo tempo de registro;

- Porcentagem de sono de ondas lentas (SOL), definido por ondas de amplitude média e alta, e baixa frequência de ondas corticais com presença de fusos; calculado pelo tempo despendido nessa fase dividido pelo tempo de registro;

- Porcentagem de sono de transição (ST), caracterizado pela presença de ondas teta com alta frequência de fusos. A porcentagem foi calculada pelo tempo em ST dividido pelo tempo de registro;

- Porcentagem de sono paradoxal (SP), definido como baixa amplitude e alta frequência de ondas corticais, ritmo teta hipocampal e atonia muscular, dividido pelo tempo de registro;

- Número médio de episódios de V, SOL, ST e SP, sendo o número total de episódios de cada uma dessas fases, dividido pelo tempo total de registro;

- Duração média dos episódios de V, SOL, ST e SP: resultante da divisão do tempo total de cada uma dessas fases pelo número de episódios das respectivas;

O número de transições entre estágios foi computado através do programa Ratatouille, desenvolvido no software R, em colaboração com o Prof. Dr. João Ricardo Sato, da Universidade Federal do ABC.

Número de transições entre dois ou três estágios de sono/vigília (ex:

V→SOL, SOL→SP)

Privação de sono

A privação de sono foi realizada da mesma forma como descrito no Experimento 1.

Procedimento experimental

Os animais foram submetidos à cirurgia para implante de eletrodos para registro de EEG e, 14 dias após a cirurgia, foi realizado o registro de sono basal por 48 h.

Logo após, todos os animais foram habituados ao tanque de privação, diariamente, por 1 h durante 3 dias. Após esse período os animais foram distribuídos aleatoriamente em 2 grupos: controle de gaiola (CG) e privado de sono (PS). Os animais do grupo PS foram submetidos à privação de sono enquanto que os animais do grupo CG foram colocados no tanque de privação por 1 h por dia. Ao final da PSP (96h), os animais receberam uma injeção de veículo ou de uma das drogas (7 horas após início da fase clara) e foi realizado o registro eletrocorticográfico e eletromiográfico por 24 h.

Análise Estatística

Os parâmetros de sono (porcentagem de cada episódio, número de episódios e duração média de cada episódio) foram analisados por meio da ANOVA de duas vias, tendo como fatores principais Grupo (CG e PS) e Tratamento (Veículo e Droga) para a primeira hora de registro. Para a comparação das demais horas de registro foi utilizada a ANOVA de três vias para medidas repetidas, tendo como fatores Grupo, Tratamento e Horas (2 h, 3 h e 4 h de registro). A análise do número de transições de estágios de sono e vigília também foi feita por ANOVA de duas vias, utilizando os fatores Grupo e Tratamento. As análises a posteriori foram realizadas pelo teste de Newman-Keuls e o nível de significância foi estabelecido em p < 0,05.

Resultados Gaboxadol

A Figura 8 mostra a porcentagem dos estágios de sono e vigília apresentada em cada grupo ao longo das quatro horas de registro. Como podemos observar, os animais despenderam mais tempo em vigília na primeira hora do registro do que nas demais, portanto a análise do padrão de sono foi realizada separadamente para a primeira hora.

Figura 8. Porcentagem dos estágios de sono e vigília em cada hora, em média.

Vigília

1. Primeira hora a. Tempo total

A Figura 9 apresenta a porcentagem de vigília na primeira hora. A análise estatística revelou efeito do Grupo (F(1,26)= 46,92; p<0,001), sendo que os animais privados permaneceram menos tempo acordados; e efeito da Droga (F_(1,26)=7,28 ; p=0,01), revelando que os grupos que receberam gaboxadol despenderam mais tempo em vigília .