Padronização do HPLC

Apesar do HPLC (High Performance Liquid Chromatography) ser uma excelente técnica para quantificação de analitos, com alta sensibilidade, esse método possui alguns pontos negativos. O principal deles é o processo de estabilização do equipamento, que demanda muito tempo. Foi exatamente nesse ponto que encontramos dificuldade, pois apesar do sistema estar montado e pronto para a quantificação das monoaminas e seus metabólitos, toda vez que iniciamos uma nova determinação com uma fase móvel nova é necessário ajustar o tempo de retenção dos padrões de acordo com as condições da coluna e das amostras. Esse ajuste é realizado por alterações no pH, na polaridade ou aumento/redução da quantidade de octil-sulfato de sódio (agente pareador de íons) da fase móvel (Kontur, 1984; Ikarashi & Maruyama, 1985). Trabalhamos com a recirculação da fase móvel (devido à grande quantidade de amostras), de modo que 1 L de fase móvel é suficiente para quantificar aproximadamente 100 amostras sem que haja alterações na linha base ou na resolução dos picos. Assim, quando ocorre a saturação da fase móvel ou seu tempo de uso ultrapassa quatro semanas, devemos troca-la e realizar uma nova padronização. O método que utilizamos para a detecção dos neurotransmissores é o eletroquímico, no qual as moléculas são oxidadas em um eletrodo de vidro/carbono a um potencial de +0,85 V em relação a outro eletrodo de referência Ag-AgCl. Dessa forma, qualquer alteração na fase móvel produz variação no detector. O detector deve estar sempre estável, para que não ocorram variações na linha de base, que prejudicam a análise do cromatograma, o que pode demorar horas, ou até mesmo dias, para acontecer. O conjunto desses fatores torna o processo de padronização trabalhoso e prolongado.

Demos início à padronização e após algumas tentativas obtivemos uma boa separação dos picos dos padrões (Figura 7.1). Procedemos assim à realização da primeira corrida, com amostras do Experimento 2. Após finalizar todas as leituras da placa (uma placa completa demora cerca de 48 h para ser lida), observamos alguns problemas nos cromatogramas das amostras, como por exemplo: flutuação da linha de base, picos enormes de 5-hidroxiindolacético (5HIAA), perda da leitura da noradrenalina e baixa recuperação do controle interno (DHBA), devido aos extensos

volumes mortos da coluna (void) e pico de substâncias não retidas presentes nas amostras (Figura 7.2).

Figura 7.1: Cromatograma do padrão geral. Sequência dos picos: noradrenalina, dopamina, 3,4- diidroxifenilacético, serotonina, ácido 5-hidroxiindolacético e ácido homovanílico.

Figura 7.2: Cromatograma de uma amostra da primeira corrida. Pode-se observar flutuação da linha de base, pico enorme de 5HIAA e extenso pico de substâncias não retidas, resultando em perda da leitura de noradrenalina e baixa recuperação do DHBA.

Dessa forma, não demos continuidade à leitura das amostras e começamos a trabalhar na solução desses problemas. O primeiro passo foi substituir a fase móvel antiga por uma nova fase móvel, eliminando a flutuação da linha de base. Em seguida focamos em obter a leitura da noradrenalina e aumentar a recuperação do DHBA. Alguns dos fatores que podem causar aumento da extensão do void e do pico de substâncias não retidas são: 1) desgaste da pré-coluna, 6.2) excesso de impureza nas amostras e 3) desgaste da coluna. Substituímos a pré-coluna antiga por uma nova e testamos uma amostra. O pico de noradrenalina continuou fundido ao void e a taxa de recuperação do DHBA foi baixa (Figura 7.3). Tentamos reduzir as impurezas da amostra, adicionando 2 µL de ácido perclórico, para cada 100 µL de amostra, em tubos com filtro acoplado e repetimos a centrifugação a 20.000 g por 25 min. O resultado não foi satisfatório, além de não antecipar a eluição das substâncias não retidas, que continuou demasiadamente prolongado, englobando o pico de noradrenalina, além de o ácido perclórico ter fragmentado os picos dos neurotransmissores e diminuído suas amplitudes (Figura 7.4). Optamos então por

tentar estender a corrida e aumentar o tempo de retenção dos analitos, para “fugir” do

void. Para isso, mexemos na polaridade da fase móvel, através da adição de água ou

tampão, em diferentes proporções. Após inúmeros testes conseguimos aumentar o tempo de retenção do DHBA e sua recuperação, porém ainda não conseguimos detectar noradrenalina (Figura 7.5). Além disso, a mudança na polaridade da fase móvel provocou variações na linha de base e achatamento dos últimos picos.

Figura 7.3: Cromatograma de uma amostra após a troca da pré-coluna. Pico de noradrenalina continuou próximo ao void e a recuperação do DHBA baixa.

Figura 7.4: Cromatograma de uma amostra após a tentativa de purificação da amostra. Não houve redução do void e os demais picos se fragmentaram.

Figura 7.5: Cromatograma de uma amostra após alterarmos a polaridade da fase móvel. Melhor recuperação do DHBA, porém a noradrenalina não foi detectada.

Nossa última alternativa foi verificar o desgaste da coluna. Retiramos a pré- coluna e realizamos a recuperação da coluna. Essa recuperação consistiu em lavar a coluna com solventes orgânicos de polaridades crescentes (Metanol 50% > Metanol 100% > Acetonitrila 100% > Acetonitrila 75% + Isopropanol 25% > Isopropanol 100% > Cloreto de metileno 100% > Hexano 100%) (Majors, 2003). Após a recuperação da coluna, conseguimos obter o pico de noradrenalina na amostra, porém a recuperação do DHBA continuou baixa (Figura 7.6). Então trocamos a coluna antiga por uma coluna nova. Com a mudança da coluna, tivemos que padronizar a faze móvel novamente e dessa vez o detector não ficava estável, porém conseguimos obter o pico de noradrenalina e boa recuperação do DHBA (Figura 7.7). Preparamos uma nova móvel

e reiniciamos o processo de padronização. Diversos testes foram realizados até obtermos uma boa separação dos picos dos padrões (Figura 7.8). Iniciamos a segunda corrida, dessa vez com amostras do Experimento 1. Verificamos os cromatogramas dessa corrida e apesar da presença do pico de noradrenalina e boa recuperação de DHBA nas amostras, os picos das outras moléculas estavam com uma amplitude muito baixa (principalmente serotonina e 5HIAA) (Figura 7.9).

Figura 7.6: Cromatograma de uma amostra após a recuperação da coluna. Presença do pico de noradrenalina, porém baixa taxa de recuperação do DHBA.

Figura 7.7: Cromatograma de uma amostra após trocarmos a coluna antiga por uma nova. Presença do pico de noradrenalina e boa recuperação do DHBA, porém muita instabilidade na linha de base.

Figura 7.8: Cromatograma do padrão geral com a coluna nova após substituirmos a fase móvel. Ótima separação dos picos e linha de base estável.

Figura 7.9: Cromatograma de uma amostra da segunda corrida. Presença do pico de noradrenalina e boa recuperação do DHBA, porém os picos das indolaminas apresentaram amplitude muito baixa.

Testamos então uma amostra na qual esperávamos encontrar grande quantidade de serotonina e 5HIAA (hipocampo de animal privado de sono paradoxal). Novamente os picos foram muito baixos. Desconfiamos que o problema poderia estar no processo de extração da amostra, então descongelamos a outra metade do encéfalo de um animal experimental e realizamos a extração novamente. Corremos a amostra no HPLC e o resultado foi o mesmo da amostra que já havia sido extraída.

Voltamos à coluna antiga, padronizamos a fase móvel e testamos diferentes amostras (inclusive amostras de outros alunos que já haviam realizado o HPLC anteriormente e que encontraram picos expressivos de serotonina e 5HIAA). Todas as amostras testadas apresentaram picos sutis. Desconfiamos que talvez o problema fosse o detector. No padrão geral, no qual as concentrações das moléculas são elevadas, todos os picos apareciam; então talvez o detector não estivesse respondendo às baixas concentrações dessas moléculas. Realizamos testes com

diluições seriadas do padrão geral e em todas elas os picos estavam presentes, mesmo que pequenos. Pensamos também na possibilidade de que algo na amostra estava impedindo a leitura dos picos. Para verificar essa hipótese, contaminamos uma amostra com uma concentração conhecida do padrão geral e observamos os picos na amplitude esperada.

Uma das explicações para não detectarmos as indolaminas nas amostras poderia ser o fato dessas moléculas serem mais instáveis. Talvez elas pudessem ter se degradado, tanto na amostra congelada quanto nas metades de encéfalos congelados (uma vez que eles já haviam sido descongelados). Como o detector também não estava estabilizando, mesmo com fases móveis novas, desmontamos a célula do detector eletroquímico e realizamos a limpeza dos eletrodos de trabalho (vidro-carbono), de referência (Ag-AgCl) e auxiliar (aço inoxidável). O detector continuou instável mesmo após a limpeza da sua célula. Então optamos por trocar a célula do detector eletroquímico por outra de um detector que estava com a parte elétrica queimada. Somente após a troca da célula o detector voltou a estabilizar, possibilitando a leitura das amostras. Entretanto, as amostras que passaram pelo aparelho antes do conserto do detector foram perdidas, pois a separação dos picos foi afetada pelo mal funcionamento do detector. Além disso, durante a leitura dos cromatogramas observamos que a maioria das amostras não apresentaram quantidades detectáveis dos metabólitos 3,4-diidroxifenilacético e ácido homovanílico, assim, essas análises não foram realizadas.

7.3. Determinação das concentrações plasmáticas de noradrenalina e