• Análise da evolução ponderal – Durante a indução da obesidade
A análise do peso corporal dos animais foi realizada três vezes por semana até o 120° dia de vida. Para as medidas foi utilizada balança digital da marca Kmach®, com capacidade máxima 700g e mínima 1g.
• Análise da ingestão alimentar e consumo de água – Durante a indução da
obesidade
A análise da ingestão de água e alimentos foi realizada três vezes por semana do 21° ao 120° dia de vida. Neste período os animais foram divididos dois grupos experimentais:
Normonutridos (n=23) que receberam ração comercial padrão de biotério Presence® e Obesos
(n=25) que receberam ração hipercalórica (ocidentalizada). Três dias foram utilizados para a adaptação às gaiolas e à dieta. Para as medidas da ingestão alimentar será utilizada balança
eletrônica com capacidade para 4 Kg e sensibilidade 0,1g (Marte, modelo S-4000®).
• Análise da ingestão alimentar e consumo de água durante o tratamento
antiobesidade por extratos de Canela (C. zeylanicum)
A análise da ingestão alimentar e consumo de água durante o período do tratamento antiobesidade foi realizado durante 21 dias. O alimento era removido e pesado para obtenção do consumo por diferença entre a quantidade oferecida e a rejeitada.
Neste período os animais dos grupos Normonutridos (n=23) e Obesos (n=25) foram divididos em seis subgrupos: Normonutridos Controle (n=06) que receberam ração comercial padrão de biotério Presence® e administração diária por via intra-gástrica (gavagem) de água filtrada; Normonutridos Extrato Bruto Folha da Canela (n=08) que receberam ração comercial padrão de biotério Presence® e administração diária por via intra-gástrica (gavagem) de dose do extrato bruto da folha da canela (C. zeylanicum); Normonutridos Extrato Bruto
Casca da Canela (n=09) que receberam ração comercial padrão de biotério Presence® e
administração diária por via intra-gástrica (gavagem) de dose do extrato bruto da casca da canela (C. zeylanicum); Obesos Controle (n=08) que receberam ração hipercalórica (dieta ocidentalizada) e administração diária por via intra-gástrica (gavagem) de água filtrada; Obesos
Extrato Bruto Folha da Canela (n=08) que receberam ração hipercalórica (dieta
ocidentalizada) e administração diária por via intra-gástrica (gavagem) de dose do extrato bruto da folha da canela (C. zeylanicum); Obesos Extrato Bruto Casca da Canela (n=09) que
receberam ração hipercalórica (dieta ocidentalizada) e administração diária por via intra- gástrica (gavagem) de dose do extrato bruto da casca da canela (C. zeylanicum);
As doses terapêuticas de segurança utilizadas para o tratamento antiobesidade pelos extratos de Canela (C. zeylanicum) foram determinadas após testes de toxicidade aguda oral, realizados antes do início dos experimentos.
• Coleta de amostras para realização de estudos hematológicos e
bioquímicos.
Aos 120° dia de vida, os animais dos respectivos grupos experimentais, foram submetidos a um jejum de 12h e anestesiados com Ketamina e Xilazina (45 mg/kg) intramuscular, em seguida foi feita a coleta de amostra de sangue por punção cardíaca. O sangue foi acondicionado em dois tipos de tubo: um com anticoagulante HB (Laborlab®) para determinação dos parâmetros hematológicos, e o outro, em tubos Vacutainer® sem anticoagulante, para obtenção do soro para avaliação dos parâmetros bioquímicos. Em seguida a punção cardíaca diferentes órgãos foram retirados para análise histológica e os encéfalos foram também obtidos depois de retirada da cabeça com guilhotina. Os encéfalos foram acondicionados em criotubos mantidos em caixas isotérmicas contendo gelo seco e em seguida foram estocados em freezer -80°C para estudos posteriores.
• Análise do perfil hematológico
Os valores para eritrócitos, leucócitos, plaquetas, hemoglobina, hematócrito e os índices hematimétricos volume corpuscular médio (VCM), hemoglobina corpuscular média (HCM) e concentração de hemoglobina corpuscular média (CHCM) foram determinados imediatamente após a coleta por meio do analisador automático de células hematológicas Advia 120/hematology (Siemens) do Laboratório de Análises Clínicas do Hospital das Clínicas (HC).
A contagem diferencial de leucócitos foi realizada em extensões coradas com May-Grünwald- Giemsa. Em cada ensaio, 100 células foram analisadas e contadas.
• Análise do perfil bioquímico
Para análise do perfil bioquímico, o material coletado foi centrifugado a 3500 rpm durante 10 minutos e, em seguida, foram determinados os parâmetros de ureia, creatinina, aspartato aminotransferase (AST), alanina aminotransferase (ALT) e fosfatase alcalina (ALP). Os ensaios foram realizados no Laboratório de Doenças Carenciais e Metabólicas - UFRPE, através do aparelho AU680 Chemistry Analyzer, analisador de dosagens bioquímicas que utiliza sistema analítico químico totalmente automatizado. Todos os kits foram utilizados de acordo com as especificações do fabricante.
• Análise do perfil histológico
Esta análise teve como objetivo avaliar o padrão morfológico e patológico dos órgãos. Foram analisados: fígados e rins, quanto à presença de lesão, hipertrofia e acúmulo de gordura, após a fixação prévia das amostras em solução de formol a 10% por 24 horas. Em seguida foram feitos cortes do tecido, inseridos nos cassetes histológicos e dispostas para processamento em um aparelho Histotécnico automatizado OMA modelo CM 69, onde o material foi submetido a uma serie de graduação de etanol à 70%, 85%, 95% e três sequências de etanol a 100% (100%1, 100%2, 100%3), por sessenta minutos, xilol 1 e 2 por sessenta minutos em cada, e parafina 1 e 2 aquecida a 56°C por sessenta minutos cada. Após este processo, o material foi emblocado em parafina.
Para a realização dos cortes na espessura de 5µm foi utilizado o micrótomo marca LEITZ modelo 1512. Todos os tecidos foram corados usando a técnica de hematoxilina-eosina para observação dos aspectos histomorfológicos do tecido. O preparo das lâminas obedeceu aos
seguintes passos: os cortes foram desparafinizados em duas passagens pelo xilol (5 minutos cada), hidratados em duas passagens por álcool 100%, seguidos por álcool 90% por 3 minutos cada, lavados em água por 5 minutos e corados por 2 minutos com hematoxilina de Harris (responsável pela coloração do núcleo da célula). Em seguida foram lavados novamente com água corrente por 5 minutos e corados pela eosina (responsável pela coloração do citoplasma e tecido conjuntivo) por 1 minuto; na sequência desidratados na bateria de desidratação por duas vezes de 3 minutos cada, passando por sequência de álcool sendo 70%, 95%, 100%, após foram lavados com xilol 2 vezes de 3 minutos cada, secados e fixados com lamínula de vidro. Também foram feitas lâminas com a coloração de tricômico de Masson e Prata. Após este procedimento, as amostras foram encaminhadas para a leitura histológica, onde foi avaliado por microscopia óptica se houve dano histológico nos órgãos dos animais, comparando-se os grupos.