Parâmetros avaliados na padronização das metodologias analítica

Devido às diferenças intrínsecas das amostras para análise, os testes de seletividade, precisão, exatidão e robustez foram realizados utilizando como diluente a água ultra- pura (considerando a análise da matéria-prima) ou a solução tampão fosfato salino (PBS) com conservantes pH=7,4 (considerando o meio de liberação in vitro).

Os valores de área obtidos pela integração da área dos picos cromatográficos serão representados em unidades arbitrárias (u.a.).

4.1.1.1. Seletividade

A avaliação da seletividade foi realizada por comparação do perfil cromatográfico da solução de cianocobalamina padrão diluída 50µg/mL, solução de cianocobalamina matéria-prima diluída 50µg/mL, cianocobalamina padrão diluída em tampão PBS- conservantes 6µg/mL e placebo (tampão PBS-conservantes).

4.1.1.2. Linearidade

A curva de calibração foi construída a partir da solução estoque do padrão (500µg/mL), diluindo-se em água ultra-pura a fim de obter concentrações de cianocobalamina de 1µg/mL, 2µg/mL, 5µg/mL, 10µg/mL, 20µg/mL, 50µg/mL, 100µg/mL e 150µg/mL.

A curva foi construída, relacionando-se a área média dos picos de cinco injeções e a concentração teórica em cada nível. A equação da reta e o coeficiente de correlação (r) foram obtidos pelo método dos mínimos quadrados. Para cada concentração foi calculado a média das leituras, o desvio padrão e o coeficiente de variação (C.V.). A relação linear foi avaliada aplicando-se teste “t” de Student, utilizando-se software SSPS 14.0.

4.1.1.3. Precisão

Repetibilidade (precisão intra-corrida)

O teste de repetibilidade foi realizado sob duas condições: a) Teste de repetibilidade 1

A repetibilidade do método foi testada através de 15 determinações, dentro do intervalo linear do método, ou seja, 5 injeções de cada uma das soluções de

cianocobalamina padrão diluída 5µg/mL, 10µg/mL e 20µg/mL, utilizando água ultra- pura como diluente. As áreas correspondentes aos picos foram tratadas estatisticamente para obtenção do desvio padrão, C.V. e limites de confiança (α=0,05). b) Teste de repetibilidade 2

A precisão do método foi testada através de 6 (seis) determinações consecutivas da amostra de concentração de 5µg/mL cianocobalamina padrão diluída em tampão PBS- conservantes. A partir das áreas dos picos calculou-se o desvio padrão, C.V. e limites de confiança (α=0,05).

Precisão intermediária (precisão inter-corrida)

Foram estabelecidos os seguintes procedimentos para teste de precisão intermediária: a) Teste de precisão intermediária 1

A precisão intermediária foi realizada em dias diferentes com equipamentos diferentes. As soluções de cianocobalamina padrão diluída com concentrações de 5µg/mL, 10µg/mL e 20µg/mL diluídas em água ultra-pura foram injetadas no primeiro dia no equipamento Shimadzu HPLC System (Japão), incluindo uma bomba quaternária (LC- 10 AT VP), auto-injetor (SIL-10AS), detector UV-VIS (SPD-10A VP), forno (CTO-10AS VP) e software para integração dos picos CLASS VP 6.13SP2. No segundo dia, novas preparações de iguais concentrações de cianocobalamina padrão foram injetadas no equipamento Shimadzu HPLC System (Japão), incluindo uma bomba quarternária (LC-10AD VP), auto-injetor (SIL-10AD VP), detector DAD (SPD-M10A VP), forno (CTO-10AS VP) e software para integração dos picos CLASS VP versão 5.42. As áreas obtidas a partir de cinco injeções, em cada um dos equipamentos, foram tratadas estatisticamente para cálculo do desvio padrão e do C.V..

b) Teste de precisão intermediária 2

A precisão intermediária foi realizada em dois dias diferentes com analistas diferentes, utilizando cianocobalamina padrão diluída em tampão PBS-conservantes (5µg/mL). As áreas obtidas a partir de seis injeções consecutivas a cada dia foram tratadas

estatisticamente para cálculo do desvio padrão e do C.V. e comparadas aplicando-se teste “t” de Student (α=0,05), utilizando-se software SSPS 14.0.

4.1.1.4. Exatidão a) Teste de exatidão 1

O teste de exatidão foi realizado pela adição de quantidade conhecida de padrão a uma solução de cianocobalamina matéria-prima utilizando água ultra-pura como diluente.

Pesou-se exatamente cerca de 50mg cianocobalamina matéria-prima e transferiu-se quantitativamente para balão volumétrico de 100mL, completou-se o volume e homogeneizou-se. Em seguida, diluiu-se 10 vezes a fim de obter solução contendo 50µg/mL de cianocobalamina matéria-prima.

Para testar a recuperação do padrão, transferiu-se, quantitativamente, 1,0mL da solução de cianocobalamina matéria-prima (50µg/mL) para balões de 10mL. Em seguida, procedeu-se conforme descrito abaixo:

a) Adicionou-se 5,0 mL da solução de cianocobalamina padrão diluída (50µg/mL), completou-se o volume com água ultra-pura e homogeneizou-se.

b) Adicionou-se 1,0 mL da solução de cianocobalamina padrão estoque (500µg/mL), completou-se o volume com água ultra-pura e homogeneizou-se.

c) Adicionou-se 2,0 mL da solução de cianocobalamina padrão estoque (500µg/mL), completou-se o volume com água ultra-pura e homogeneizou-se.

Cada solução foi injetada em triplicata.

Utilizando a equação da reta do teste de linearidade, determinou-se a recuperação da cianocobalamina a partir dos valores das médias obtidos.

A diferença entre o valor recuperado e o valor teórico foi comparada aplicando-se teste “t” de Student (α=0,05), utilizando-se software SSPS 14.0.

b) Teste de exatidão 2

Este teste de exatidão foi realizado por contaminação do placebo com quantidade conhecida de cianocobalamina padrão.

Para testar a recuperação do padrão, transferiu-se, quantitativamente, 50mg de microesferas branca (Formulação 1) para balões volumétricos de 10mL com auxílio de água ultra-pura. Em seguida, procedeu-se conforme descrito abaixo:

- Adicionou-se 1,0mL da solução de cianocobalamina padrão diluída 50µg/mL, completou-se o volume com tampão PBS-conservantes e homogeneizou-se.

- Adicionou-se 2,0mL da solução de cianocobalamina padrão diluída 50µg/mL, completou-se o volume com tampão PBS-conservantes e homogeneizou-se.

- Adicionou-se 3,0mL da solução de cianocobalamina padrão diluída 50µg/mL, completou-se o volume com PBS-conservantes e homogeneizou-se.

- Adicionou-se 5,0mL da solução de cianocobalamina padrão diluída 50µg/mL, completou-se o volume com PBS-conservantes e homogeneizou-se.

Cada solução foi injetada em triplicata.

Calculou-se a recuperação de cada preparação por comparação proporcional da área média de cada amostra com a área da solução padrão diluída de 5µg/mL.

A diferença entre o valor recuperado e o valor teórico foi comparada aplicando-se teste “t” de Student (α=0,05), utilizando-se software SSPS 14.0.

4.1.1.5. Robustez a) Teste de robustez 1

O teste de robustez foi realizado pela variação da temperatura da coluna cromatográfica em ± 2°C. A amostra da solução padrão de cianocobalamina diluída em água ultra-pura na concentração de 5µg/mL foi injetada três vezes a temperatura de 25°C, depois a 23°C e, novamente, três vezes, a 27°C. As médias das áreas dos picos obtidas a 23°C e a 27°C foram comparadas com a média das áreas dos picos obtida pelas injeções da mesma solução a 25°C através da análise de variância e teste Tukey (α=0,05) .

b) Teste de robustez 2

Para testar a robustez do método, variou-se a temperatura da coluna cromatográfica em ± 2°C. A amostra da solução padrão de cianocobalamina diluída em tampão PBS- conservantes na concentração de 5µg/mL foi injetada três vezes a temperatura de 25°C, depois a 23°C e, novamente, três vezes, a 27°C. As médias das áreas dos picos obtidas a 23°C e a 27°C foram comparadas com a média das áreas dos picos obtida pelas injeções da mesma solução a 25°C através da análise de variância (α=0,05). c) Teste de robustez 3

Para testar a robustez do método, variou-se o diluente da solução padrão. Utilizou-se água ultra-pura ou tampão PBS-conservantes como diluentes a fim de obter soluções de cianocobalamina padrão na concentração final de 5µg/mL Cada solução foi injetada três vezes sob condições normais de operação do método. A média da área dos picos da solução padrão diluída foi comparada com a média das injeções da solução de cianocobalamina padrão diluída em tampão PBS-conservantes através do teste “t” de Student (α=0,05).