Parâmetros físicos importantes

As micropartículas são rapidamente desaceleradas em conseqüência do atrito com o ar, devido a sua massa reduzida. Para que haja uma minimização desse efeito nos principais sistemas de biobalística descritos (com exceção dos sistemas hand-

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held), a quantidade de ar na câmara deve ser reduzida com auxílio de uma bomba de vácuo. O vácuo deve ser mantido a uma pressão em torno de 710 mm de Hg. Vácuo acima desse nível não conduz a uma melhor freqüência de expressão do gene introduzido, provavelmente por causa da redução do vapor residual de água da própria amostra biológica. Para certas aplicações o vácuo deve ser reduzido, como no caso do bombardeamento de células animais em cultura e animais in vivo (Johnston et al., 1991). Em alguns casos, gás hélio é injetado na câmara de vácuo, de forma que substitua o ar residual. A adição do gás hélio, de baixo peso molecular e baixa densidade, aumenta a eficiência de transformação, provavelmente pela redução do atrito e conseqüente diminuição da desaceleração. Esse fato tem sido observado principalmente em microrganismos, onde se utilizam micropartículas menores (0,2 µm). Em bactérias, o aumento da eficiência pode chegar a 6 vezes e, em leveduras, a até 4 vezes (Sanford et al., 1993; Smith et al., 1992). No caso de plantas, onde se empregam partículas até cinco vezes maiores (1,0 µm), a injeção de hélio na câmara de bombardeamento não apresenta efeito significativo na eficiência de transformação (Sanford et al., 1993).

Outro parâmetro muito importante que deve ser otimizado para cada tipo celular são as distâncias entre as células-alvo e o ponto de origem das partículas ou da fonte geradora de energia para movê-las. No caso dos equipamentos de gás hélio a alta pressão, deve-se otimizar a distância entre a membrana de ruptura e a membrana carreadora de partículas (macrocarreador), a distância entre a membrana carreadora até a tela de retenção e desta até o tecido-alvo. Isto é importante devido ao fato de ondas de choque e acústica se propagarem pelo interior do equipamento no momento do disparo. Estas, necessárias para a aceleração do macrocarreador, podem causar danos às células-alvo (Russell et al., 1992). A intensidade e forma dessas ondas variam conforme as distâncias entre a fonte geradora da onda de choque (membrana de ruptura) e o macrocarreador, entre o macrocarreador e a tela de retenção, e desta até as células-alvo. Esses parâmetros também influem na velocidade final das micropartículas, sua capacidade de penetração e, conseqüentemente, na eficiência da transferência e expressão gênica (Kemper et al., 1995; Kikkert, 1993; Sanford et al., 1993).

Outro parâmetro importante é a pressão do gás hélio. Na maioria dos casos essa pressão é de 1.200 psi, entretanto, deve ser ajustada para cada tecido a ser bombardeado. Uma pressão muito alta pode acarretar dano aos tecidos enquanto

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pressões mais baixas podem levar a uma baixa penetração das partículas, que podem não atingir os tipos celulares desejados em cada tecido-alvo.

1.4.4. Os vetores

O processo biobalístico é bastante influenciado por algumas das características dos vetores empregados, com efeitos marcantes sobre a introdução e integração dos genes exógenos nas células. O DNA plamidial pode ser precipitado sobre micropartículas, acelerado e introduzido, tanto na forma circular quanto linear. O tamanho do vetor aparentemente não é um fator limitante (Lacorte et al., 1997; Sanford et al., 1993). Entretanto, há uma limitação da massa de DNA que poderá ser adsorvida às micropartículas. Grandes quantidades de DNA tendem a gerar aglomerados de micropartículas (Aragão et al., 1993; Lacorte et al., 1997). Teoricamente, 400 a 800 cópias de um plasmídio de 10 kb são adsorvidas em uma micropartículas com 1,2 µm de diâmetro médio. Estes aglomerados causam danos às células devido às suas dimensões e massa. O número de cópias dos genes introduzidos é um fator importante para sua expressão transiente (Lacorte et al., 1997), no entanto, a influência sobre a integração ainda necessita ser investigada. Finalmente, como o tamanho do vetor (DNA plasmidial) é diretamente proporcional à sua massa e inversamente proporcional ao número de cópias possível de ser precipitado sobre as micropartículas, deve-se então dar preferência a vetores pequenos, entre 2-15 kb. A freqüência de transformação estável, isto é, a obtenção de plantas transformadas, parece ser um pouco reduzida quando da utilização de vetores lineares (Bonfim et al., 2007; Vianna et al., 2004). Entretanto, devido a questões de biossegurança pode-se optar pela utilização de vetores lineares. Esses vetores são produzidos após a remoção (pela digestão com enzimas apropriadas) de seqüências gênicas que conferem resistência a antibióticos, presentes nos vetores circulares. É recomendável que o vetor circular possua um sítio para uma enzima que permita a digestão e eliminação de genes desnecessários para o processo de transformação genética. É possível a co- transformação, com a utilização de dois ou três vetores simultaneamente. Isto permitirá a segregação dos transgenes nas gerações seguintes. As freqüências de co- transformação para genes presentes em um único vetor são de cerca de 100%

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enquanto que para genes presentes em vetores distintos é de cerca de 50% (Aragão et al., 1996).

Os plasmídios utilizados no processo biobalístico não necessitam de nenhuma seqüência moduladora da sua integração no genoma vegetal, ao contrário dos vetores de Agrobacterium. Em levedura (Orr-Weaver et al., 1981) e algumas espécies de Synechococcus (Williams & Szalay, 1983), a integração do DNA exógeno ocorre devido a seqüências homólogas ao DNA cromossomal (recombinação homóloga). A integração do DNA exógeno, introduzido por métodos diretos no genoma de células vegetais parece ser diferente. Aparentemente sua integração independe de presença de seqüências homólogas no genoma vegetal (Ilda et al., 1990; Morikawa et al., 1994). Entretanto, o mecanismo de integração ainda necessita ser mais bem compreendido.