Neste capítulo, serão descritos as formas de obtenção e caracterização dos fosfatos de cálcio estudados e os procedimentos para a obtenção das isotermas de adsorção.
Os reagentes que foram utilizados estão listados na Tab. 2, na qual a fórmula, pureza e procedência dos mesmos são informadas. Os materiais volumétricos empregados, como os balões volumétricos de 5,00; 10,00; 25,00 e 50,00 mL foram devidamente calibrados e, as pipetas automáticas ( de 1 a 5 mL e 200 a 1000 µL), aferidas quinzenalmente. As especificações dos demais equipamentos, como os instrumentos de análise, pHmetro e câmara de agitação serão apresentadas no próprio texto onde estes equipamentos são citados.
Tab. 2: Lista e descrição dos reagentes utilizados no desenvolvimento deste trabalho.
Fórmula Nome Especificação Marca
CaCO3 Carbonato de cálcio - J. T. Baker
CaHPO4 Monohidrogeno fosfato
de cálcio
98,4 % J. T. Baker
N2H4 . H2O Hidrato de hidrazina 60 % Aldrich
CH3CH2OH Etanol PA-ACS 99,5 % Synth
HNO3 Ácido nítrico PA-ACS 64 – 66 % Synth
KH2PO4 Dihidrogeno fosfato de
potássio
Zn(NO3)2 .6 H2O Nitrato de zinco hexahidratado PA Synth SrCl2 . 6 H2O Cloreto de estrôncio hexahidratado ∼ 95 % Fluka Chemika Pb(NO3)2 Nitrato de chumbo II PA-ACS 99 % CAAL
NaNO3 Nitrato de sódio PA-ACS QEEL
NH4OH Hidróxido de amônio PA min. 25 % Merck
Zn Zinco metálico PA min. 85 % Carlo Erba
KOH Hidróxido de potássio PA-ACS min. 85 % Nuclear
III - 1. Obtenção dos Fosfatos de Cálcio
III - 1. 1. Síntese por Precipitação
O método de síntese utilizado foi baseado no trabalho realizado por Morgan e colaboradores, para obtenção de hidroxiapatita (HAP) [60]. Em um béquer, foi preparada uma suspensão de carbonato de cálcio (CaCO3) e monohidrogeno
fosfato de cálcio (CaHPO4) em água deionizada, em uma proporção tal que a
razão Ca/P igual a 5 / 3, correspondente à da HAP, fosse obtida. A suspensão foi mantida em repouso por 72 h em estufa, à temperatura de 90 °C, sendo feitas agitações esporádicas.
Após este período, o sólido resultante foi separado da fase líquida através de decantação, submetido a cinco lavagens com água deionizada e a aquecimento a 400 °C, por 3 horas em mufla.
Durante o desenvolvimento deste projeto, foram realizadas duas sínteses e seus produtos serão designados por HAP – 1 (1ª síntese) e HAP – 2 (2ª síntese).
III - 1. 2. Extração de Fase Óssea Inorgânica
Inicialmente, fêmures e calotas cranianas de 26 ratos wistar cedidos pelo CEMIB – UNICAMP foram dissecados. A seguir, foram fragmentados após imersão em nitrogênio líquido, para proporcionar maior exposição da matéria orgânica ao tratamento.
Para a digestão da parte orgânica, os ossos foram tratados com hidrazina, de forma semelhante à reportada por Termine e colaboradores [61]. O material lavado com soluções de etanol e água foi seco ao ar, triturado e passado por peneira para análise granulométrica com abertura de 0,25 mm. A fase óssea inorgânica extraída foi denominada por HAP-R.
III - 2. Caracterização dos Fosfatos de Cálcio
III - 2. 1. Razão Ca / P
A razão Ca / P foi determinada aplicando-se a técnica de espectroscopia de emissão ótica por plasma (ICP-OES), utilizando-se o instrumento Perkin-Elmer 3000 DV.
Para a determinação da razão Ca / P, cerca de 50 mg do fosfato de cálcio seco foram dissolvidos em balão volumétrico de 25,00 mL pela adição de 200 µL de ácido nítrico concentrado. 750 µL da solução resultante foi diluída em balão volumétrico de 10,00 mL, antes de ser analisada. Para as amostras de HAP-R, após a dissolução no balão volumétrico de 25,0 mL, foi efetuada uma filtração, em papel de filtro, para a remoção de resíduos não digeridos pelo tratamento com hidrazina. As concentrações de Ca e de P nas soluções foram determinadas a partir de curvas analíticas preparadas com os padrões carbonato de cálcio (CaCO3), para o cálcio e dihidrogeno fosfato de potássio (KH2PO4), para o fósforo.
III - 2. 2. Difração de Raios X
Os difratogramas de raios X das amostras em pó de HAP-1, HAP-2, HAP-R e de CaCO3, e CaHPO4 foram gerados no instrumento Shimadzu DRX – 6000,
utilizando fonte de radiação Cu Kα (λ = 1,5418 Å), nas condições de voltagem de 40 kV, corrente de 30 mA e varredura de 2 º min-1.
III - 2. 3. Espectroscopia na Região do Infravermelho
Os espectros de infravermelho foram obtidos em pastilha de KBr, no instrumento FTIR B-100, MB-Series, Bomem. Foram analisadas as amostras de HAP-1, HAP-2, CaCO3 e CaHPO4 com 16 acumulações e resolução de 4 cm-1 e,
as amostras de HAP – R, com 256 acumulações e resolução de 4 cm-1.
III - 3. Determinação das Isotermas de Adsorção
III - 3. 1. a. Isotermas de Adsorção em HAP-1 e HAP-2
As isotermas de adsorção foram determinadas utilizando-se cerca de (200 ± 0, 1) mg de HAP e 5,00 mL da solução do íon metálico (Zn2+, Sr2+ ou Pb2+), cuja força iônica foi ajustada em 0,9 % m / v pela adição de NaNO3. O pH das soluções
foi ajustado (5,0; 5,5; 6,0 e 6,5), mediante adição de solução diluída de hidróxido de amônio (NH4OH) ou de ácido nítrico (HNO3), utilizando-se um pHmetro (B-474,
Micronal).
Após o ajuste de pH, as soluções foram adicionadas sobre as amostras de HAP, e as suspensões foram mantidas em frascos fechados, em uma incubadora (incubadora shaker MA 420 – Marconi) a 37º C, por 24 horas, com agitação
constante de 30 rpm. Após este período, os conteúdos dos frascos foram submetidos à centrifugação de 3000 rpm, por 10 minutos, para separação das fases sólida e líquida (sobrenadante). Os valores de pH dos sobrenadantes foram medidos utilizando-se papel indicador universal (escala de 0 a 14), não sendo observadas variações significativas de pH após os processos de adsorção.
III - 3. 1. b. Isotermas de Adsorção em HAP-R
Na obtenção das isotermas de adsorção em HAP-R foram utilizados cerca de (100 ± 0, 1) mg de HAP-R aos quais foram adicionados 2,50 mL de solução de adsorbato (soluções contendo íons Zn2+ ou Sr2+ ou Pb2+), nas mesmas condições
de força iônica e de pH descritas em III. 3. A. 1. A proporção massa de adsorvente / volume de adsorbato foi mantida igual à usada para HAP-1 e HAP-2.
Na obtenção das isotermas de adsorção em HAP-R, foram verificadas variações de pH maiores que as observadas para as adsorções em HAP-1 e HAP- 2. Por esta razão, as adsorções em HAP-R foram conduzidas, de forma análoga às adsorções em HAP-1 e HAP-2, com e sem o monitoramento e ajuste de pH ao longo da adsorção.
Para as adsorções onde foi efetuado o ajuste de pH, 160 µL do indicador de Arrhenius, descrito no Apêndice 2, foram adicionados às soluções de adsorbato, cuja força iônica e pH inicial foram previamente ajustados. Os ajustes de pH foram efetuados pela adição de solução de HNO3 a 5 %, imediatamente, 8 horas e 21
horas após a adição do adsorbato à HAP-R. Os volumes totais de solução de ácido nítrico gastos para a realização destes ajustes de pH foram cerca de 50 µL.
Após o período de 24 horas, em que as suspensões foram mantidas em frascos fechados, a 37º C, por 24 horas, sob agitação constante de 30 rpm, as fases sólida e líquida (sobrenadante) dos frascos foram separadas por centrifugação, assim como foi feito para HAP-1 e HAP-2.
Um experimento para a determinação da cinética de adsorção de Sr2+ em HAP-R, para pH = 6,0 (monitorado e ajustado ao longo da cinética) foi realizado, para se avaliar o tempo suficiente para que a adsorção atingisse o equilíbrio.
III - 3. 2. a. Quantificação dos Íons Zn
2+, Sr
2+, Pb
2+e Ca
2+A quantificação dos íons Zn2+, Sr2+ e Pb2+ foi conduzida pela análise dos sobrenadantes amostrados após as adsorções, para as HAP-1, HAP-2 e HAP-R, e também pela análise direta dos sólidos após as adsorções, para as HAP-1 e HAP- 2. A determinação dos íons Ca2+ foi efetuada através da análise dos
sobrenadantes, apenas para as adsorções em HAP-R. As técnicas empregadas em tais determinações estão citadas na Tab. 3.
III - 3. 2. a. 1. Preparação das Amostras dos Sobrenadantes
Para a análise dos sobrenadantes, as alíquotas retiradas após o processo de centrifugação, empregando-se pipetas automáticas ( 1 - 5 mL e de 200 - 1000 µL), foram diluídas em solução 2 % de HNO3, em balões volumétricos. O mesmo
procedimento foi adotado na determinação das concentrações iniciais das soluções de adsorbato.
III - 3. 2. a. 2. Preparação das Amostras dos Sólidos
Na análise direta dos sólidos, depois do processo de separação das fases líquida e sólida, e retirada da alíquota do sobrenadante, os conteúdos dos tubos foram submetidos à filtração comum e à lavagem. Para tal, após a transferência do sólido, cada frasco utilizado foi lavado com duas porções de água deionizada, de 5 mL cada uma. Após o escoamento do líquido do funil, o sólido retido pelo
papel de filtro foi lavado com duas porções de 10 mL de água deionizada. Os sólidos foram secos, juntamente com o papel de filtro, em estufa a 90 ºC, durante 24 h e, a seguir, aproximadamente 150 ± 0,1 mg foram dissolvidos em balões de 5,00 mL, por adição de 300 µL de HNO3 concentrado.
III - 3. 2. b. Técnicas Analíticas
As técnicas de análise empregadas neste trabalho foram: titulação complexométrica, espectroscopia de absorção atômica (AA), fluorescência de raios X (FRX) e espectroscopia de emissão ótica por plasma indutivamente acoplado (ICP-OES).
Porém, dificuldades decorrentes das próprias condições experimentais para a determinação das isotermas de adsorção, limitaram a aplicação das técnicas de titulação complexométrica e espectroscopia de absorção atômica, na quantificação dos íons Zn2+, Sr2+, Pb2+ e Ca2+. Estas dificuldades, bem como os aspectos relevantes destas técnicas e os resultados através delas obtidos, são reportados e discutidos no Apêndice 3.
III - 3. 2. b. 1. Fluorescência de Raios X (FRX)
As análises empregando-se a técnica de FRX foram realizadas no instrumento EDX – 700 (Energy Dispersive X-Ray Spectrometer), da Shimadzu.
Para cada amostra, foram analisados 2,00 mL de solução, durante um tempo de aquisição de sinal de 200 s. As quantificações dos íons foram feitas a partir de curvas analíticas (Apêndice 1), empregando-se como padrões das soluções: zinco metálico (para Zn2+); nitrato de chumbo II anidro (para Pb2+) e monohidrogeno fosfato de estrôncio (para Sr2+).
III - 3. 2. b. 2. Espectroscopia de Emissão Ótica por Plasma
Indutivamente Acoplado (ICP-OES)
As medidas por ICP-OES foram realizadas com o instrumento Perkin-Elmer 3000 D V. As curvas analíticas foram obtidas empregando-se os mesmos padrões de Zn2+, Sr2+ e Pb2+ descritos para a técnica de FRX (Apêndice 1). Para os íons
Ca2+, foi utilizado carbonato de cálcio como padrão.
A Tab. 3 mostra em quais determinações, no sobrenadante e no sólido as técnicas de FRX e de ICP-OES foram empregadas.
Tab. 3: Técnicas empregadas nas determinações quantitativas de íons. Adsorvente (pH)
Material para
Análise
Íons Técnica HAP-1 (pH = 5,5) Sobrenadante Zn2+, Sr2+ FRX HAP-1 (pH = 6,5) Sobrenadante e Sólido Zn2+, Sr2+I FRX HAP-2 (pH = 6,0) Sobrenadante e Sólido Zn2+, Sr2+ FRX HAP-2 (pH = 5,0 e 5,5) Sobrenadante e Sólido Pb2+ FRX HAP-R (pH = 5,0sem controle) Sobrenadante
Zn2+, Sr2+, Pb2+ e Ca2+
ICP-OES
HAP-R (pH = 5,0 e
6,0 com controle) Sobrenadante
Zn2+, Sr2+, Pb2+ e Ca2+