I.2.1 Materiais e Métodos (Procedimentos Gerais)
1 - Os solventes utilizados no preparo dos extratos, na solubilização das amostras, nas eluições em CCDC, CCDP e CC foram: acetato de etila, hexano, clorofórmio, diclorometano e metanol (grau analítico procedência Quimex e Quemis).
2 - Nos processos de separação por cromatografia em coluna os adsorventes utilizados como fase estacionária foram sílica-gel 60 (0,063-0,200 mm e 0,040-0,063 mm - “sílica Flash”) da Across Co e Sephadex LH-20 da Pharmacia, para procedimentos de permeação em gel.
3 - Nos procedimentos de cromatografia em camada delgada comparativa foram utilizadas placas da Merck Kieselgel 60 F254 (0,25 mm de sílica-gel com indicador de fluorescência
UV254).
4 - Nas separações por cromatografia em camada delgada preparativa foram utilizadas placas da Merck Kieselgel 60 F254 (1 mm de sílica-gel com indicador de fluorescente UV254).
5 - Os métodos de revelação utilizados nas cromatografias em camada delgada consistiram na exposição das placas à radiação, empregando-se, em gabinete apropriado, lâmpada ultravioleta nos comprimentos de onda de 256 e 366 nm (Spectroline – Model CM-10, Fluorescence Analysis Cabinet), vapores de iodo ou reagente de Liebermann-Burchard. Para o preparo deste reagente foram previamente misturados 10 mL de ácido sulfúrico concentrado e 10 mL de anidrido acético e, posteriormente, essa mistura foi cuidadosamente adicionada à 50 mL de etanol resfriado em banho de gelo.
6 - Os evaporadores rotatórios utilizados para evaporação de solventes sob pressão reduzida foram das marcas BUCHI 461 e IKA LABORTECHINIK HB4 basic, com temperatura em geral entre 35 e 60 ºC.
7 - As temperaturas de fusão foram determinadas em um aparelho Microquímica MQAPF- 301.
8 - Os espectros no IV foram obtidos em um Espectrofotômetro de IV por Transformada de Fourier, modelo IRAffinity-1, da Shimadzu. Os espectros foram obtidos em pastilhas de KBr, e quando oleosas, como filmes em placa de NaCl.
9 – As análises por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectometria de massas foram realizadas em dois equipamentos distintos, no Laboratório de Análise e Sínteses de Agroquímicos da UFV/MG e no Laboratório de Pesquisa e Desenvolvimento em Química da UFBA/BA. Os equipamentos e condições de análises são descritos a seguir:
9.1. Na UFV-MG: Os cromatogramas das amostras foram obtidos em um equipamento de cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas de baixa resolução (CG-EM) da Shimadzu, com detector seletivo de massas, modelo QP 5050A. A Coluna cromatográfica e condições de análises foram: coluna Elite-5 (5% de fenil, 95% dimetilpolissiloxano) de 30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e espessura do filme de 0,25 µm. Fluxo de gás de arraste (He) foi de 1,8 mL.min-1; a
temperatura do injetor foi 220 oC; a temperatura da interface foi 240 ºC; e a temperatura
inicial da coluna foi de 40 oC, aumentando 3 oC.min-1, até atingir 240 oC, permanecendo
cada amostra dissolvida em diclorometano, na concentração de 10.000 µg.mL-1. As
condições do espectrômetro de massas foram: energia de impacto 70 eV; velocidade de varredura 1000; intervalo de varredura de 0,5 e registro da razão m/z de 30,00 a 500,00.
9.2. Na UFBA-BA: Os cromatogramas das amostras foram obtidos em um equipamento de cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas de baixa resolução (CG-EM) da Shimadzu, com detector seletivo de massas, modelo QP 2010. A Coluna cromatográfica e as condições de análises foram: coluna DB-5MS (5%-fenil-95% metilpolisiloxano) de 30 m de comprimento, 0,25 mm de diâmetro interno e espessura do filme de 0,25 µm. Fluxo de gás de arraste (He) foi de 1,8 mL.min-1; a temperatura do injetor
foi 290 oC; a temperatura da interface foi 290 ºC; e a temperatura inicial da coluna foi de 100 oC, aumentando 6 oC. min-1, até atingir 285 oC, permanecendo constante nesta temperatura
por 28 minutos. A razão de split 1/27; volume injetado 1 µL de cada amostra dissolvida em hexano, na concentração de 10.000 µg.mL-1. As condições do espectrômetro de massas
foram, energia de impacto 70 eV; velocidade de varredura 1000; intervalo de varredura de 0,5 e registro da razão m/z de 30,00 a 600,00.
10 - Os cromatogramas obtidos por inserção direta foram registrados em um cromatógrafo em fase gasosa acoplada à espectrometria de massas de baixa resolução (CG-EM) da Shimadzu CG-2010, com detector seletivo de massas, modelo QP 2010.
11 - Uma mistura com padões de ésteres metílicos foi adquirido (FAME mix C8-C24 da Supelco Analytical – USA).
12 - Os espectros de massas de baixa e alta resolução foram adquirios em equipamento Shimadzu LCMS-2010 e Brucker LC-MS-microTOF, respectivamente.
13 - Os espectros de Ressonância Magnética Nuclear uni e bidimensionais foram registrados em espectrômetros Varian GEMINI 2000 e Varian Inova 500.
I.2.2 Coleta do Material Vegetal e Identificação da Espécie
Partes da planta em estudo, Piper klotzschianum, tais como folhas, caules, raízes e sementes, foram coletados para o preparo de exsicatas. A coleta foi realizada em Janeiro de 2007, em Vila do Riacho-Aracruz, ES, sendo suas exsicatas identificadas pela Profa. Dra. Elzie Flanklim Guimarães e depositadas no herbário do Jardim Botânico do Rio de Janeiro com registro nº 480408, 480409 e 480410.
I.2.3 Preparo dos Extratos
Raízes (1,56 kg) de Piper klotzschianum foram cortadas em pequenos pedaços e secas à temperatura ambiente e subsequentemente em estufa com circulação de ar a 40 ºC.
Em seguida, triturados em liquidificador industrial até obtenção de um pó finamente granulado. O pó obtido foi submetido à extração a frio, com Hex, DCM e EtOH, respectivamente. Após as extrações, os solventes foram removidos em evaporador rotatório sob pressão reduzida para obtenção dos extratos hexânicos, diclometánicos e etanólicos. Os extratos das raízes foram denominados: HJB (11,7 g), DJB (9,1 g) e EJB (14,3 g) - extrato hexânico, diclorometánico e etanólico das raízes do João Barandi, respectivamente.
I.2.4 Isolamento dos Constituintes Químicos de Piper klotzschianum I.2.4.1 Fracionamento do Extrato Hexânico das Raizes - HJB
O extrato hexânico (11,7 g) foi incorporado em sílica-gel 60 e submetido à purificação por CC utilizando como fase móvel os solventes hexano e acetato de etila em ordem crescente de polaridade (1:0, 9:1, 8:2, 6:4, 1:1; 3:7, 1:9, 0:1). Após comparação por CCDC foram obtidas 11 frações, as quais foram submetidas a sucessivos fracionamentos em CC (Fig. I.6 e I.7, p.24 e 25). Em todas as colunas cromatográficas, a fase móvel iniciou-se com um determinado sistema de eluente, e conforme o seu comportamento cromatográfico mudava-se a fase móvel, aumentando sua polaridade até o término do fracionamento químico. As frações em azul mostradas nos fluxogramas (Fig. I.6 e I.7, p.24 e 25) correspodem às substâncias isoladas e identificadas, ou identificadas em mistura. Para a primeira coluna cromatográfica foram coletados aproximadamente 100 mL de eluente e para as demais 40 mL.