4 Resultados
4.5 Participação de eventos envolvidos na regulação do cálcio
Problemas na sinalização de cálcio intracelular ocorrem normalmente, devido à ausência de captação de cálcio externo e/ou a um sequestro rápido e exacerbado do cálcio captado para os compartimentos intracelulares. (Fu, L. e cols.., 2000; Tisi, R. e cols. 2002 e 2003 e Tokes-Fuzesi, M. e cols., 2002).
Na tentativa de entender como os mecanismos de acúmulo do cálcio em seus compartimentos, e, portanto, indisponibilidade do íon, podem estar relacionados à ativação da H+-ATPase; medimos os níveis de cálcio celular total em um grupo de
cepas que apresentaram uma diferença significativa na ativação, induzida por glicose, da enzima, quando comparadas a resposta da cepa selvagem correspondente e também duplos mutantes com reversão dos fenótipos apresentados pelos mutantes únicos.
É possível observar na figura 22, que o mutante snf3Δ, quando em presença
de galactose, apresentou níveis muito elevados de acúmulo de cálcio, significativamente diferente da cepa selvagem em qualquer uma das fontes de carbono, e do próprio mutante crescido em glicose (p<0.05). A deleção do gene que codifica para a fosfolipase C também resultou em um acúmulo exacerbado do cálcio celular, cerca de três vezes maior que os níveis observados na selvagem correspondente nas mesmas condições (p<0.05). Interessantemente, quando o cálcio celular total foi medido nos duplos mutantes que apresentaram uma recuperação nos níveis de ativação da H+-ATPase, este fenótipo de reversão também se repetiu.
Não houve diferença significativa na resposta apresentada pela cepa
pmc1Δsnf3Δ, quando comparada a cepa selvagem em meio de crescimento
suplementado com galactose (p>0.05). Isto sugere que uma hiper ativação da bomba Pmc1p seja responsável pelo acúmulo observado no mutante snf3Δ, e ainda reforça a
ideia de que o sensor Snf3p atue como regulador do sequestro de cálcio mediado por esta Ca+2- ATPase vacuolar.
O nível de cálcio total obtido pelo duplo mutante snf3Δplc1Δ, crescido em
glicose, foi muito baixo, comparável a cepa selvagem (p>0.05) e significativamente menor que o mutante com deleção apenas do gene SNF3 (p<0.05). Porém, o mais impressionante foi que quando comparada à cepa plc1Δ, a resposta deste duplo
mutante foi aproximadamente 10 vezes menor (p<0.05). Este resultado explica a reversão dos baixos níveis de ativação da H+- ATPase nos mutantes snf3Δ e plc1Δ.
As recuperações dos níveis normais de acúmulo de cálcio observadas neste experimento são condizentes com as respostas apresentadas quando a ativação da H+-ATPase, induzida por glicose ou galactose, foi avaliada.
Figura 22 – Concentrações de cálcio celular total em cepas S. cerevisiae (background
BY4741) crescidas em meio YP glicose (colunas azuis) ou YP galactose (colunas vermelhas). As cepas foram crescidas até a densidade de + 1 DO600nm/mL. Dez
unidades DO600nm, foram coletadas por centrifugação e lavadas com YP fresco. O Ca+2
total foi então medido por espectrofotometria de absorção atômica.
aOs valores das médias mostrados são estatisticamente diferentes daqueles apresentados pela
cepa selvagem e entre si (p< 0.05). a
a
a a
Considerando que a bomba Pmc1p constitui um importante componente no metabolismo de cálcio em leveduras e diante destes resultados quanto ao acúmulo deste íon, optamos por instituir uma metodologia que nos permitisse avaliar a atividade desta Ca+2- ATPase nas cepas e condições de interesse. Para tanto, foi necessária a
extração e o fracionamento da membrana subcelular segundo Becherer, K. A. e cols. (1996).
De acordo com Lisman, Q. e cols. (2004), um fracionamento de membrana subcelular de leveduras, em gradiente de sacarose, apresenta algumas propriedades importantes. Nas 20 frações do topo ao fundo do tubo, observam-se, em faixas contínuas, concentrações maiores ou menores das membranas de cada organela. Seus dados demonstram que, a membrana citoplasmática encontra-se mais presente nas frações 17, 18, 19 e 20. Para a membrana do retículo endoplasmático, a coleta das frações de 3 a 11, parece ser a mais confiável, ao passo que na faixa de frações de 8 a 12 provavelmente está em maior proporção a membrana do complexo de golgi, Diante destes relatos e tendo em vista que a proteína de nosso interesse encontra-se na membrana vacuolar, realizamos um ensaio de atividade ATPásica (Becher dos Passos, J. e cols., 2002), na presença ou não de 500 μM de CaCl2,
concentração final, com cada uma das frações, isoladamente. Neste peneiramento foram selecionadas as frações que apresentaram níveis de atividade na presença de CaCl2 significativamente superiores àqueles observados no ensaio realizado na
ausência do íon (p<0.05). Ao fim deste processo foram selecionadas as frações 15, 16, 17 e 18.
Para confirmar a presença da Ca+2 - ATPase e de uma maior concentração da
membrana subcelular de vacúolo, estas frações foram submetidas também a um ensaio de atividade na presença de 500 μM de CaCl2 acrescidos de 2mM, final, do
quelante EGTA. As frações 16 e 17 apresentaram uma redução drástica nos níveis de atividade e na fração 15 essa redução também ocorreu, porém em níveis menos intensos. Por outro lado, a reposta da fração 18 não foi afetada pela presença do quelante. Diante disso passamos a utilizar uma mistura das frações 15, 16 e 17, para a obtenção da ativação da Ca+2– ATPase vacuolar, Pmc1p.
Avaliamos então os efeitos da deleção de genes que codificam para proteínas envolvidas na via de ativação da H+- ATPase, sobre a atividade de Pmc1p. Os efeitos
foram também avaliados quanto à fonte de carbono utilizada no crescimento e na indução das células.
Os resultados obtidos na análise da cepa selvagem demonstram que esta atividade Ca+2- ATPásica é significativamente maior em galactose (p<0.05), condição
na qual o balanço dos metabólitos de glicose está comprometido. Isto explicaria porque a ativação da H+- ATPase é sempre inferior nestas condições quando
comparada a resposta em glicose (Figura 23). Os dados demonstram ainda que as duas cepas mutantes que apresentam baixos níveis tanto da taxa de bombeamento de prótons quanto da atividade enzimática, snf3Δ e plc1Δ, possuem uma Ca+2- ATPase
Figura 23 – Medida da atividade enzimática específica da Ca+2- ATPase, Pmc1p, em
cepas S. cerevisiae (background BY4741) crescidas em meio YP glicose e induzidas com glicose 100 mM (colunas azuis) ou YP galactose e induzidas com galactose 100 mM (colunas vermelhas). As cepas foram crescidas em 500 mL de meio rico até atingirem DO600nm = 1.0. O ATP foi utilizado a uma concentração final de 2 mM e a
atividade expressa em nmoles de Pi. min-1. mg de proteína-1.
Todos os valores das médias mostrados são estatisticamente diferentes daqueles apresentados pela cepa selvagem em glicose (p< 0.05).
4.6 – Envolvimento da proteína quinase C, Pkc1p, na ativação, induzida por