Participantes

Dans cette dernière partie de ce chapitre nous allons tenter de déterminer le

mécanisme par lequel les agonistes purinergiques inhibent la mobilisation des pools

calciques par le carbachol et l’adrénaline. La stimulation des récepteurs P

2

X

4

par

l’ATP pourrait modifier la régulation de la phospholipase C et la production d’IPs ou

encore la fixation de l’IPs sur son récepteur et par conséquent la sortie du calcium

des réservoirs intracellulaires. Pour ce faire nous avons mesuré l’effet de l’ATP sur

la libération d’inositols phosphates en réponse au carbachol ou à l’adrénaline. Les

acini préparés selon la technique décrite dans le chapitre II paragraphes n.2.3 et

n.2.4 sont prémarqués avec de l’inositol tritié et préincubés après lavage dans le

milieu I pendant 10 min en présence de LiCl 10 mM et en absence de magnésium.

Les acini sont ensuite incubés pendant 5 min en présence ou en absence d’ATP 1

mM. A la fin de cette préincubation, les acini sont stimulés avec du carbachol 100

pM ou avec l’adrénaline 100 pM. Le même protocole expérimental décrit ci dessus a

été répété sur un deuxième lot de cellules à une seule différence. Les cellules dans ce

cas étaient préincubées pendant deux heures à température ambiante (25°C), en

présence ou en absence d’ATP oxydé 100 pM. La technique du dosage des inositols

phosphates est décrite dans le chapitre II, paragraphe II.2.12.

Les résultats présentés dans la Figure V.9 montrent que le carbachol augmente de

6 fois la production des inositols phosphates (IP). L’ATP 1 mM, quant à lui, n’a

pratiquement pas d’effet sur la libération des IP. Son effet se manifeste plutôt par une

inhibition de 50 % de la production des IP en réponse au carbachol. L’ATP a

également un effet inhibiteur du même ordre sur la libération des IP en réponse à

l’adrénaline. Les mêmes conclusions peuvent être tirées des expériences reproduites

en présence de l’antagoniste spécifique des récepteurs purinergiques de type P2X?,

l’oATP. Dans ces conditions, l’effet inhibiteur de l’ATP 1 mM sur la production des

IP en réponse au carbachol ou à l’adrénaline persiste.

Ces dernières expériences nous permettent non seulement de renforcer notre

hypothèse quant à l’effet inhibiteur de l’ATP sur la mobilisation des pools calciques

par le carbachol, mais également de donner une preuve supplémentaire de

l’implication des récepteurs purinergiques de types P

2

X

4

(et pas P2Xv) dans cette

«O

O

U

3

■O

Q.

Figure V.9: Effet de l’ATP sur la libération des inositols phosphates en réponse

au carbachol et l’adrénaline en présence ou en absence d’ATP oxydé.

Les acini sous-maxillaires de rat prémarqués avec [^H]-inositol sont préincubés

pendant 10 min à 37°C en présence de LiCl 10 mM et de CaClz 1 mM, en absence de

magnésium. Des aliquots sont incubés pendant 2 heures avec 100 pM oATP

(colonnes hachurées). Les cellules sont ensuite exposées au carbachol 100 pM (Cb)

ou à l’adrénaline 100 pM (Ad). L’effet de l’ATP 1 mM est testé sur des aliquots de

cellules qui ont été incubés pendant 5 minutes avec l’ATP 1 mM. Le dosage des IP

est décrit dans le chapitre H. Paragraphe II.2.12. Le dosage est fait en triple pour

chaque expérience. Les résultats sont les moyennes +s.e.m de 3 expériences.

V.3 Discussion

Nous avons comparé dans la première partie de ce chapitre les interactions

entre les agents purinergiques et les agents muscariniques dans les deux composantes

cellulaires majeures de la glande sous-maxillaire. Un effet inhibiteur de l’ATP sur la

réponse au carbachol ou à l’adrénaline a déjà été décrit dans la suspension brute de la

glande sous-maxillaire (Métioui et a/.,1996; Hurley et al, 1993). Nous montrons

dans ce travail que la réponse au carbachol n’est pas inhibée dans une préparation

enrichie en cellules ductales, alors qu’elle est inhibée de 90 % dans la préparation

acinaire. C’est donc au niveau des acini que l’effet inhibiteur de l’ATP sur la réponse

au carbachol se manifeste. L’implication des récepteurs purinergiques dans cette

inhibition est confirmée par le fait qu’une préincubation des acini avec le bleu de

Coomassie rétablit la réponse au carbachol après l’ATP. L’effet inhibiteur de l’ATP

sur le carbachol a été reproduit par le BzATP. Les autres analogues de l’ATP tels que

le 2MeSATP (un agoniste des récepteurs P2Yi dans les glandes salivaires) ou encore

rUTP (un agoniste des récepteurs P

2

Y

2

dans les glandes salivaires) n’ont aucun effet

sur la réponse au carbachol (résultats non montrés). Ceci suggère que cette inhibition

est due à l’activation des récepteurs purinergiques de type P2X.

Deux classes de récepteurs P2X ont été décrits dans les glandes sous-

maxillaires; P

2

X

4

et P2X? (Buell et al., 1996a; Alzola et al., 1998). Ces deux

récepteurs forment un canal cationique non spécifique et sont activés par la forme

tétraanionique de l’ATP ou par le BzATP. Le récepteur P2Xj est localisé au niveau

des acini (Buell et al., 1996a). Le récepteur P2X? est exprimé dans les canaux

(Alzola et al, 1998; Lee et al, 1998). Nous avons montré dans le chapitre IB que les

acini sous-maxillaires exprimaient les deux types de récepteurs P

2

X

4

et P

2

X

7

. Les

récepteurs P2X? sont sélectivement inhibés par l’ATP oxydé (Murgia et al, 1993). Il

est généralement admis que l’inhibition exercée par les agonistes purinergiques sur la

réponse aux récepteurs muscariniques dans les glandes salivaires est due au récepteur

P

2

X

7

(ou le récepteur P2Z selon l’ancienne nomenclature) (Hurley et al, 1993;

Jorgensen et al, 1995; Métioui et al, 1996). L’inhibition de la réponse muscarinique

suite à une activation du récepteur purinergique de type P

2

X

7

a également été

proposée par Fukuchi, (1999) dans les cellules acinaires des glandes parotides de rat.

phosphatidylcholines membranaires via la phospholipase D. L’activation de la

protéine kinase C par les produits de cette hydrolyse (l’acide phosphatidique et le

diacylglycérol) est à l’origine de la phosphorylation d’un grand nombre de protéines,

entre autres la protéine récepteur à l’acétylcholine. Les récepteurs P2Xt seraient

aussi impliqués dans l’inhibition de la réponse à l’adrénaline (Hurley et al., 1993).

Nos résultats nous permettent de suggérer que l’inhibition de la réponse

muscarinique par l’ATP (ou le BzATP) serait plutôt due à l’activation des récepteurs

purinergiques de type P

2

X

4

. Plusieurs arguments sont en faveur de notre hypothèse.

1) Nous montrons dans ce chapitre que l’inhibition de la réponse

muscarinique par l’ATP ou par son analogue le BzATP se manifeste dans les acini et

pas dans les canaux. Seuls les acini expriment le récepteur P

2

X

4

.

2) Nous montrons également que l’augmentation de la [Ca^^]i obtenue lorsque

nous stimulons les acini avec un agoniste purinergique (ATP ou BzATP) est inhibée

par le bleu de Coomassie ou par l’ATP oxydé. L’inhibition par le bleu de Coomassie

permet de rétablir la réponse au carbachol dans les acini. Par contre, l’incubation des

acini avec l’ATP oxydé ne lève pas cette inhibition. Les récepteurs P

2

X

7

ne sont

donc pas responsables de cette inhibition. Nous avons obtenu les mêmes effets de

l’ATP sur l’adrénaline, un autre agent qui élève la [Ca^^i via les mêmes mécanismes.

La réponse à l’adrénaline est complètement abolie quand les cellules acinaires sont

traitées auparavant par l’ATP. Nous pouvons en déduire que la stimulation du

récepteur P

2

X

4

serait à l’origine de l’inhibition de la réponse des acini au carbachol

et à l’adrénaline.

La réponse au carbachol comprend deux phases. Nous avons voulu savoir si

l’effet inhibiteur de l’ATP s’exerce sur la mobilisation et/ou sur l’influx de calcium.

L’effet inhibiteur des agonistes purinergiques est observé en absence de calcium

extracellulaire, ceci suggère que l’ATP bloque la mobilisation des pools

intracellulaires de calcium.

Selon le modèle capacitatif, la libération du calcium des pools intracellulaires

ouvre des canaux calciques au niveau de la membrane plasmique les SOCC (store-

operated calcium channels). Nous avons utilisé la thapsigargine à la place du

carbachol pour mobiliser les pools calciques. La thapsigargine bloque les Ca^"^-

ATPases localisées sur les membranes du réticulum endoplasmique. L’ATP n’affecte

pas la libération du calcium intracellulaire observée en présence de la thapsigargine.

Ces expériences ont été réalisées en présence de Ni^^. Ce cation bivalent inhibe la

captation du calcium par les récepteurs P2X (Chaïb et al, 1998a). L’ATP n’a aucun

effet sur la libération du calcium des pools intracellulaires en présence du Ni^^.

Il a été montré que l’inhibition exercée par l’ATP sur le carbachol dans les

glandes sous-maxillaires n’est pas due à une interaction entre l’ATP et le récepteur

muscarinique (Hurley et al, 1993), mais bloque plutôt l’augmentation de la

concentration intracellulaire d’IP

3

en réponse au carbachol (Jorgensen et al, 1995;

Métioui et al, 1996). Nous confirmons ces résultats par le dosage de la production

des inositols phosphates en réponse au carbachol ou à l’adrénaline dans les acini

préincubés en présence d’ATP. Le dosage des IP réalisé en présence d’ATP oxydé

montre que l’antagoniste des récepteurs P2X? ne lève pas l’effet inhibiteur de l’ATP.

Ce résultat nous fournit une preuve supplémentaire de l’implication du récepteur

purinergiques P

2

X

4

dans l’inhibition de la réponse des neurotransmetteurs couplés à

la voie de la phospholipase C: carbachol et adrénaline.

Il a été récemment montré que le récepteur à l’IPs localisé sur le réticulum

endoplasmique et les SOCC localisés au niveau de la membrane plasmique sont

couplés (Kiselyov et al, 1998). Les agonistes purinergiques semblent inhiber

l’ouverture des SOCC en réponse au carbachol en inhibant l’augmentation de la

concentration d’IPs et par conséquent l’activation du récepteur à l’IPs. Le mécanisme

impliqué dans cette inhibition reste encore inexpliqué.

La rapidité de l’inhibition de la réponse muscarinique (30 sec) et son

irréversibilité sont similaires à celles déjà décrites dans une suspension brute des

glandes parotides (Jorgensen et al, 1995; Fukuchi, 1999) ou des glandes sous-

maxillaires (Hurley et al, 1993; Métioui et al, 1996). Ceci suggère que la

stimulation des récepteurs P

2

X

4

modifie la régulation de la phospholipase C et la

production d’IPs. Ceci n’exclut pas la possibilité d’une éventuelle inhibition au

niveau de la fixation d’IPs sur la protéine récepteur.

Une interaction entre les récepteurs cholinergiques et les récepteurs P2X a été

décrite dans le système nerveux sympathique (Barajas-Lopez et al, 1998). Ces

auteurs ont proposé l’existence d’une relation fonctionnelle entre les canaux formés

par les récepteurs nicotiniques et ceux formés par les récepteurs purinergiques de

type P2X dans les neurones sous-muqueux. L’influx des ions à travers l’un active un

mécanisme qui inhibe l’autre type de canal. Searl et Silinsky (1998) ont également

décrit une interaction entre les récepteurs cholinergiques et les récepteurs P2X.

Une autre interaction entre les récepteurs muscariniques et les récepteurs

P

2

X

4

dans les glandes salivaires a été rapportée par Tenneti et al. (1998). Ces auteurs

montrent que les terminaisons nerveuses parasympathiques régulent négativement

l’expression des récepteurs P

2

X

4

dans les acini parotidiens. Nos résultats suggèrent

une régulation réciproque, l’activation des récepteurs P

2

X

4

bloquerait la réponse des

agonistes muscariniques dans les acini sous-maxillaires.

Nous montrons dans ce chapitre que la stimulation par l’ATP du récepteur

P

2

X

4

exprimé dans les acini sous-maxillaires inhibe la réponse aux agonistes

muscariniques. Ce récepteur présente une particularité, il est insensible aux

antagonistes des récepteurs purinergiques tels que le suramin et le PPADS (Garcia-

Guzman et al., 1997b). En effet, il est dépourvu de résidus lysines qui sont impliqués

dans la fixation des antagonistes (mais pas des agonistes) (Buell et al., 1996a). Ceci

CHAPITRE VI: ETUDE DE LA PERMEABILISATION PAR LES

No documento Caracterização do Jogo de futsal em Indivíduos com Doença Mental Grave (páginas 66-105)