Até hoje, muito pouco é sabido a respeito dos mecanismos moleculares de
patogenicidade e virulência das leptospiras. Entretanto, a conclusão dos
seqüenciamentos genômicos de cinco cepas diferentes de Leptospira spp. abriram
um novo campo a ser explorado objetivando a compreensão dos processos
infecciosos, e elaboração de métodos profiláticos ou de diagnóstico da doença.
A “vacinologia reversa”, estratégia utilizada para identificar candidatos
vacinais a partir de dados obtidos com o seqüenciamento de genomas
(RAPPUOLI, 2001), foi empregada em bactérias como Neisseria meningitidis
sorogrupo B (PIZZA et al., 2003) e Streptococcus pneumoniae (WIZEMANN et al.,
2001), sendo muito bem sucedida. A partir da seqüência genômica, são utilizadas
ferramentas de bioinformática para a identificação de antígenos protéicos
candidatos na formulação de vacinas. Nesses moldes, os projetos de
seqüenciamentos genômicos de Leptospira spp. (REN et al., 2003; NASCIMENTO
et al., 2004a, b; BULACH et al., 2006; PICARDEAU et al., 2008) revelaram um
grande número de novas proteínas que podem estar envolvidas na patogenicidade.
Desde então, a busca de proteínas relacionadas à patogenicidade ou virulência
vem sendo perseguida por vários grupos de pesquisa no mundo, sendo que o foco
está nas proteínas de membrana e lipoproteínas (HAAKE et al., 1999; MERIEN et
al., 2000; PALANIAPPAN et al., 2002; CULLEN et al., 2003; GAMBERINI et al.,
2005; YANG et al., 2006; BARBOSA et al., 2006; VIEIRA et al., 2007; RISTOW et
al., 2007; FAISAL et al., 2008; ATZINGEN et al., 2008).
Como a superfície bacteriana é a interface entre o patógeno e o
hospedeiro, diferenças nas proteínas de membrana externa podem refletir a
variação de mecanismos de patogenicidade. Proteínas preditas lipoproteínas são
abundantes tanto em L. biflexa (164 lipoproteínas preditas), quanto nas espécies
patogênicas (184 e 130 em L. interrogans e L. borgpetersenii, respectivamente). No
entanto, mais de 90 lipoproteínas preditas nas espécies patogênicas não têm
ortólogos no genoma da espécie saprofítica, incluindo a lipoproteína majoritária
LipL32 (HAAKE et al., 2000), e outras lipoproteínas caracterizadas, como LipL41,
LipL36 e LipL45 (CULLEN et al., 2004). Lipoproteínas relacionadas com a
virulência, como as proteínas Lig (papel na adesão aos tecidos do hospedeiro)
(CHOY et al., 2007), e LenA/LfhA/Lsa24 (ligação ao fator H e laminina da matriz
extracelular) (VERMA et al., 2006; BARBOSA et al., 2006; STEVENSON et al.,
2008), também estão ausentes em L. biflexa. No entanto, a lipoproteína Loa22
(LIC10191), única até o momento identificada como essencial para a virulência,
tem um homólogo gênico na espécie saprofítica, com 73% de similaridade
(PICARDEAU et al., 2008). Isso pode indicar que seu papel é relacionado com a
sobrevivência, ao invés de ser um fator direto de virulência como proposto por
Ristow e colaboradores (2007).
É conhecido que algumas bactérias patogênicas modulam seu perfil de
expressão protéica de acordo com as condições ambientais a que estão submetidas
(STOCK et al., 1989). Ao longo do seu ciclo de transmissão, que compreende
desde órgãos de animais selvagens ou humanos, até vida livre no solo ou na água,
as leptospiras são sujeitas a condições ambientais amplamente distintas e variáveis
(HAAKE, 2000). Para se adaptarem a condições nutricionais, sinalizadoras,
quimiotáticas e de virulência tão divergentes, as leptospiras necessitam de uma
regulação do conjunto de genes expressos em cada uma dessas condições.
Embora se saiba que as leptospiras adaptam-se e sobrevivem em muitos
ambientes diferentes, pouco é sabido a respeito da natureza molecular dessas
adaptações.
Com o intuito de compreender a adaptação das leptospiras a condições
diferentes, muitos estudos in vitro vêm sendo feitos. Trabalhos recentes
demonstraram que uma mudança na temperatura da cultura de leptospiras in vitro
de 30ºC para 37ºC, mimetizando o que ocorre durante a infecção, está associada
com a síntese diferencial de várias proteínas de membrana externa, periplasmáticas
e citoplasmáticas (NALLY et al., 2001). Foi demonstrado que várias dessas
proteínas termoreguladas são imunogênicas, e reagem com soros de animais
infectados convalescentes, provavelmente tendo um papel importante na interação
patógeno-hospedeiro, sendo possíveis fatores de virulência e patogenicidade
(NALLY et al., 2001). Outros estudos de análise transcripcional do genoma, por
técnica de microarranjos (QIN et al., 2006), demonstraram que L. interrogans tem
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diversas classes funcionais de proteínas expressas diferencialmente durante a
mudança de temperatura. No trabalho publicado por Lo e colaboradores (2006),
também foi demonstrado, por experimentos de microarranjos, que há diferença
transcricional de genes de mobilidade e quimiotaxia, sistemas transdutores de
sinais e proteínas alteradoras da membrana quando ocorre mudança de
temperatura. Portanto, a temperatura deve ser um fator importante regulando a
expressão de proteínas que facilitam a invasão e estabelecimento da doença.
Aliados a isso, a literatura relata já há algum tempo que as leptospiras
perdem a sua virulência após algumas passagens em cultura (FAINE, 1994;
FAINE et al., 1999). Mais recentemente, esses dados foram ampliados com
diversos estudos que reportam proteínas com expressão diferencial durante os
processos infecciosos. Palaniappan e colaboradores (2002) identificaram, a partir
de um screening da biblioteca genômica de L. interrogans sorovar Pomona com soro
obtido de éguas infectadas com leptospirose, uma nova proteína altamente
imunogênica, LigA, expressa apenas durante a infecção.
Matsunaga e colaboradores (2003) mostraram resultados compatíveis com
as hipóteses de que as proteínas LigA e LigB são expressas apenas no hospedeiro
infectado, e que os genes da família lig são restritos a espécies patogênicas de
Leptospira, não sendo detectados em espécies saprofíticas não-patogênicas
analisadas. Os autores demonstraram que as proteínas LigA e LigB têm a sua
expressão correlacionada com a virulência, já que a atenuação da virulência de
leptospiras em cultura acarretou a perda da capacidade de infecção, associada à
supressão da expressão dessas proteínas. Posteriormente, Silva e colaboradores
(2007) demonstraram que a porção carboxi-terminal da LigA confere
imunoproteção parcial em hamsters inoculados com leptospiras, sugerindo o seu
potencial vacinal.
No grupo de pesquisa deste trabalho, foi caracterizada a proteína Lsa21,
que tem propriedades de adesão a componentes de matriz extracelular, é
termoregulada em temperatura fisiológica e expressa principalmente em condições
de virulência (ATZINGEN et al., 2008).
Outro exemplo de expressão diferencial é o da proteína que se liga à
fibronectina (fibronectin-binding) descrita por Mérien e colaboradores (2000),
expressa na membrana de L. interrogans sorovar Icterohaemorrhagiae virulenta,
porém, ausente em bactérias não-virulentas ou saprofíticas. Mérien e
colaboradores já haviam demonstrado em trabalho anterior (1997) que a invasão
de células Vero por leptospiras era relacionada com a virulência, já que bactérias
saprofíticas ou que tiveram sua virulência atenuada em cultura mostraram-se
incapazes de realizar a invasão. Esses dados sugerem a participação dessa proteína
no processo inicial de adesão e invasão das leptospiras.
Os trabalhos acima citados apontam para algumas das mudanças na
transcrição e expressão protéicas em condições de aumento de temperatura e de
infecção, o que abre as portas para investigações mais minuciosas a respeito da
patogênese das leptospiras, bem como para buscas de fatores de virulência e
candidatos vacinais.
No documento
Leptospira interrogans virulentas e
(páginas 32-35)