Conforme protocolo descrito neste trabalho, 64 amostras foram testadas pela PCR. Os resultados estão evidenciados nas Figuras 8, 9 e 10. As amostras consideradas negativas nas primeiras reações, foram inseridas em nova PCR, porém, com volumes acrescidos de 7 microlitros do extraído (Figura 11) ao invés de apenas 5 microlitros, por orientação da Profa. Dra. Ana Roselino (Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo - USP).
As amostras positivas nas PCR’s foram submetidas à digestão enzimática pela HAE III e os amplicons digeridos (ou não) foram aplicados em gel de poliacrilamida para visualização (Figuras 12, 13 e 14) a fim de caracterizar o subgênero (Leishmania ou Viannia) conforme padrão de digestão e migração no gel.
Figura 8 – Gel de agarose a 2% com produtos de PCR após amplificação de trecho de
DNA de Leishmania sp a partir de extraído de papel de filtro impregnado com tecido de lesão cutânea de pacientes portadores de LTA. Linhas: M, marcador de peso molecular 100pb; LA, controle positivo (L. amazonensis); LB, controle positivo (L. braziliensis); Amostras de pacientes portadores de LTA (chave): pacientes 4, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 e 17; CN, controle negativo.
M LA LB
LTA
CN
Figura 9 – Gel de agarose a 2% com produtos de PCR após amplificação de trecho de
DNA de Leishmania sp a partir de extraído de papel de filtro impregnado com tecido de lesão cutânea de pacientes portadores de LTA. Linhas: M, marcador de peso molecular 100pb; CN, controle negativo; LA, controle positivo (L. amazonensis); Amostras de pacientes portadores de LTA (chave): pacientes 1, 2, 11, 16, 18, 19, 20, 22, 25, 26, 28, 31, 33, 34, 35, 36, 41, 42, 45, 46, 47, 48, 52, 55, 56, 58 e 62.
Figura 10 – Gel de agarose a 2% com produtos de PCR após amplificação de trecho de
DNA de Leishmania sp a partir de extraído de papel de filtro impregnado com tecido de lesão cutânea de pacientes portadores de LTA. Linhas: M, marcador de peso molecular 100pb; CN, controle negativo; LB, controle positivo (L. amazonensis); Amostras de pacientes portadores de LTA (chave): pacientes 63, 64, 67, 68, 69, 70, 71, 72, 73, 74, 77, 79, 80, 81, 83, 84, 93, 94, 95, 98, 99, 100, 101, 102, 104, 105 e 106. M LTA CN 120pb LA M LTA 120pb LA CN
Figura 11 – Gel de agarose a 2% com produtos de PCR após amplificação de trecho de
DNA de Leishmania sp a partir de extraído (em volume de 7 L) de papel de filtro impregnado com tecido de lesão cutânea de pacientes portadores de LTA. Linhas: M, marcador de peso molecular 100pb; LA, controle positivo (L. amazonensis); LB, controle positivo (L. braziliensis); Amostras de pacientes portadores de LTA (chave): pacientes 1, 2, 11, 16, 18, 28, 33, 34, 35, 36, 42, 46, 57, 62, 63, 70, 73, 74, 77, 79, 80, 93, 95, 98, 99 e 100; CN, controle negativo.
Após visualização das Figuras 8, 9, 10 e 11, as amostras consideradas positivas foram submetidas à RFLP, por ação da enzima HAE III. Ao todo, 47 amostras revelaram positividade pela PCR. As Figuras 12, 13 e 14 retratam as digestões pela endonuclease de restrição. LTA CN LB LA M 120pb
Figura 12 – Gel de poliacrilamida a 10% com produtos de PCR após digestão pela
enzima HAE III. Linhas: M1, marcador de peso molecular 10pb; M2, marcador de peso molecular 50 pb; M3, marcador de peso molecular 100 pb; LTA (chave): produtos de PCR obtido a partir de extraídos de papel de filtro com imprint de lesão cutânea proveniente de pacientes portadores de LTA: pacientes 4, 8, 9, 10, 12, 13, 14, 17, 19, 20, 22, 25, 26, 31, 41 e 45; LA, cepa de referência de L. amazonensis MHOM/BR/PH8; LB, cepa de referência de L. braziliensis MHOM/BR/94/M15176; LD, cepa de referência de L. donovani.
A Figura 12 mostra que todos os pacientes apresentaram amplicons digeridos pela HAE III, evidenciando 2 bandas, uma de 80 e outra de 40pb. Assim, pode-se afirmar que trata-se de Leishmania do subgênero Viannia. Em contraste, nota-se que o material genético amplificado a partir de cepa de L. amazonensis e de L. donovani, usados como controle, não apresentou digestão, validando a reação.
LTA
M1 M2 M3 LA LB LD
80pb
Figura 13 – Gel de poliacrilamida a 10% com produtos de PCR após digestão pela
enzima HAE III. Linhas: M1, marcador de peso molecular 10pb; M2, marcador de peso molecular 50 pb; M3, marcador de peso molecular 100 pb; LTA (chave): produtos de PCR obtido a partir de extraídos de papel de filtro com imprint de lesão cutânea proveniente de pacientes portadores de LTA: pacientes 47, 48, 52, 55, 56, 58, 62, 64, 67, 68, 69, 71, 72, 81, 83, 84, 95, 101, 102, 104, 105 e 106; LA, cepa de referência de L. amazonensis MHOM/BR/PH8; LB, cepa de referência de L. braziliensis MHOM/BR/94/M15176; LD, cepa de referência de L. donovani.
A análise da Figura 13 revela que 19 das amostras amplificadas foram digeridas pela HAE III, formando 2 bandas, uma de 80 e outra de 40pb, fato específico do subgênero Viannia. Por outro lado, 1 amostra (número 83) não revelou o mesmo padrão de digestão, o que permite classificá-las como do subgênero Leishmania. Há 2 amostras (62 e 81) cujo padrão das bandas eletroforéticas não permite classificá-las quanto ao subgênero, necessitando de repetir ou ainda realizar digestão com outra enzima. Os controles amplificados a partir de cepa de L. amazonensis e de L. donovani não apresentaram digestão, validando a reação.
M1 M2 M3
LTA
LA LB LD
80pb
Figura 14 – Gel de poliacrilamida a 10% com produtos de PCR após digestão pela
enzima HAE III. Linhas: M1, marcador de peso molecular 10pb; M2, marcador de peso molecular 50 pb; M3, marcador de peso molecular 100 pb; LTA (chave): produtos de PCR obtidos a partir de amostras extraídas de papel de filtro com imprint de lesão cutânea proveniente de pacientes portadores de LTA: pacientes 16, 33, 36, 57, 63, 70, 77, 79, 100, 110, 111 e 112 (os 3 últimos não estão incluídos neste trabalho); LA, cepa de referência de L. amazonensis MHOM/BR/PH8; LB, cepa de referência de L. braziliensis MHOM/BR/94/M15176; LD, cepa de referência de L. donovani.
A Figura 14 refere-se às últimas amostras positivas na PCR, cujos respectivos produtos de amplificação foram submetidos à ação da HAE III. Observa-se digestão e produção de 2 bandas (80 e 40 pb) em 8 amostras, característica de Leishmania do subgênero Viannia, ao passo que 1 (paciente 57) não apresentou o mesmo padrão de digestão. Porém, a existência de três bandas na amostra deste paciente pode indicar, provavelmente, um caso de infecção por Leishmania donovani chagasi.
Por fim, as amostras positivas para PCR, após digestão com enzima de restrição e qualificadas quanto ao subgênero, foram contabilizadas em números absolutos e relativos (Tabela 26). 80pb 40pb M1 M2 M3 LTA LA LB LD
Tabela 26 – Resultados da caracterização dos subgêneros de Leishmania sp por meio da
técnica de PCR-RFLP utilizando a enzima HAE III em amostras de papel de filtro com imprint de lesão cutânea de 47 pacientes portadores de LTA atendidos no Ambulatório de Dermatologia/HUB, entre agosto de 2007 e julho de 2010
Subgêneros Número de casos %
Leishmania Viannia 43 91,5
Leishmania Leishmania 01 2,1 Leishmania donovani chagasi * 01 2,1
Não classificado 02 4,2
Total 47 100
* Suspeita. Necessita confirmação.
O portador de Leishmania do subgênero Leishmania (de acordo com o diagnóstico molecular executado) relatou como local de provável infecção o município de Luziânia/GO. Os 2 pacientes portadores das espécies cuja identificação foi inconclusiva relataram como local de provável contágio a região administrativa do Gama/DF e o município de Padre Bernardo/GO. O paciente cuja amostra demonstra possível infecção por L. donovani chagasi relatou local de provável infecção o município de Padre Bernardo/GO.