42 22.. PPEERRDDAA DDOO RREEFFLLEEXXOO PPOOSSTTUURRAALL
2
2..11.. MEMETTOODDOOLLOOGGIIAA
22..11..11.. ExExppeerriimmeennttoo ppiilloottoo –– rreellaaççããoo ddoossee--rreessppoossttaa
PPrroocceeddiimmeennttoo:: Vinte e quatro camundongos foram aleatoriamente alocados para três grupos (8 animais por grupo) que receberam água ou etanol nas doses de 4,0 g/kg ou 4,5 g/kg (solução 25% p/v por via oral). Imediatamente após a administração foi disparado o cronômetro para medir o tempo de latência (em minutos) para a perda do reflexo postural dos animais. Quando observado o início da perda do reflexo, os camundongos foram colocados em posição supina (barriga para cima) e caso voltassem à posição normal eram recolocados em posição supina, sendo este procedimento repetido no máximo duas vezes. Foi cronometrada a duração do efeito (em minutos) e utilizado como parâmetro indicador do término do tempo de perda do reflexo postural o momento a partir do qual os camundongos retornavam à posição ventral após terem sido recolocados em posição supina por três vezes consecutivas.
AAnnáálliissee EEssttaattííssttiiccaa:: Os parâmetros analisados foram o tempo de latência e de duração da perda do reflexo postural. Para comparação dos grupos, em relação às médias de cada parâmetro foi realizada uma análise de variância (ANOVA) de uma via, sendo os grupos (água destilada e as diferentes doses de etanol) a variável independente e a latência ou a duração da perda do reflexo as variáveis dependentes. Quando detectadas diferenças significativas pela ANOVA, foram realizados testes a posteriori de Tukey para comparar os grupos entre si. Para comparação da proporção de animais que perderam o
43 reflexo postural foi utilizado o teste do Fischer. Em todos os casos foi adotado o nível de significância mínimo de 5%.
22..11..22.. ExExppeerriimmeennttoo ccrrôônniiccoo
PPrroocceeddiimmeennttoo:: 32 camundongos foram aleatoriamente alocados para quatro grupos (8 animais por grupo) que receberam v.o. água, bebida energética (10,7 ml/kg de RedBull®), etanol na dose de 4,5 g/kg (solução 25% p/v) ou etanol (4,5 g/kg) combinado com bebida energética (10,7 ml/kg). Foi seguido o mesmo protocolo descrito acima para o experimento piloto. Após o teste agudo, os animais foram tratados durante 21 dias consecutivos e testados novamente a cada sete dias, seguindo o mesmo protocolo do teste agudo.
Teste - D1 Teste - D7 Teste - D14
Tratamento
Teste – D21 Dias
Figura 14: Protocolo utilizado no experimento crônico de perda de reflexo postural. Os animais passaram por um teste agudo (D1) e foram tratados diariamente durante 21 dias consecutivos. A cada 7 dias (D7, D14 e D21) foram testados seguindo o mesmo protocolo do teste agudo.
AAnnáálliissee EsEsttaattííssttiiccaa:: Os parâmetros analisados foram latência e duração da perda do reflexo postural. Para comparação dos grupos, em relação a cada parâmetro foi realizada uma análise de variância (ANOVA) de uma via, sendo os grupos (água, bebida energética, etanol ou etanol combinado com bebida energética) e as variáveis dependentes a latência e duração da perda do reflexo. Também foi realizada uma ANOVA de duas vias com medidas
44 repetidas, sendo a variável independente os grupos e a variável dependente (medidas repetidas) os testes agudo e após 7, 14 e 21 dias de tratamento.
Quando detectadas diferenças significativas pela ANOVA, foram realizados testes a posteriori de Tukey para comparar os grupos entre si, sendo adotado o nível de significância mínimo de 5%.
2
2..22.. RERESSUULLTTAADDOOSS
22..22..11.. ExExppeerriimmeennttoo ppiilloottoo –– rreellaaççããoo ddoossee--eeffeeiittoo
A Figura 15 mostra a porcentagem de animais que apresentou perda do reflexo postural nos três grupos. Como esperado, nenhum dos animais controle apresentou perda do reflexo. O teste de Fischer detectou diferença significativa entre a proporção de animais com perda do reflexo entre o grupo que recebeu EtOH 4,5 g/kg (56%) e a do grupo controle água (0%). Entretanto, dado o tamanho reduzido da amostra não foi detectada diferença significante entre a proporção de animais do grupo que recebeu etanol 4,0 g/kg (25%) e o grupo controle água. Também não houve diferença significante entre os grupos tratados com etanol.
45
Proporção de animais que perderam o reflexo postural
*
Figura 15: Porcentagem de animais que apresentaram perda do reflexo postural após a administração das drogas. Os camundongos receberam água (n=8) ou etanol em diferentes doses (EtOH 4,0 g/kg n=8 ou EtOH 4,5 g/kg, n=9) por via oral.
* Porcentagem maior do que do grupo controle (água), teste de Fischer p=0,02.
Quanto ao parâmetro latência para a perda do reflexo postural, observou-se efeito significativo do fator grupo (F(2,22)=3,80; p<0,05) sendo que, os animais que apenas os animais que receberam a maior dose de etanol tiveram latência significativamente menor do que os animais do grupo controle (água), cuja latência máxima foi considerada 180 minutos (período máximo de observação) como pode ser visto na Figura 16A. Não houve diferença significativa entre a latência dos animais que receberam a dose menor de etanol (4,0 g/kg) e a do grupo controle (água).
Em relação à duração da perda do reflexo postural, também foi observado efeito significativo do fator grupo (F(2,22)=4,92; p<0,05), sendo que os animais do grupo EtOH 4,5 g/kg apresentaram maior tempo de duração da perda do reflexo postural do que os do grupo controle (água), como pode ser observado na Figura 16B. Também quanto a este parâmetro não houve
46 diferença significativa entre os animais que receberam a dose menor de etanol (4,0 g/kg) e os do grupo controle (água).
Figura 16: Parâmetros da perda do reflexo postural após a administração das drogas.
Os camundongos receberam água (n=8) ou etanol em diferentes doses (EtOH 4,0 g/kg n=8 ou EtOH 4,5 g/kg, n=9) por via oral. A: Latência para perda do reflexo postural. B:
Duração da perda do reflexo postural.
* menor tempo de latência e maior duração da perda de reflexo postural do que do grupo controle (água) (p<0,05).
Desta forma, sendo que a dose de 4,5g/kg causou perda significativa do reflexo postural foi essa a dose escolhida para ser utilizada no experimento entre 33,3% e 55,6% dos animais perderam o reflexo postural. A administração de bebida energética não alterou significativamente este efeito, pois sob a ação
47 de 4,5 g/kg de etanol combinado com bebida energética (10,7ml/kg) entre 45,5% e 63,6% dos animais perderam o reflexo postural, não havendo diferença significante entre os animais que receberam apenas etanol e os que receberam etanol associado a bebida energética nos diversos testes.
0
Teste agudo D7 – após 7 dias de tratamento
D21 – após 21 dias de tratamento D14 – após 14 dias de tratamento
BE BE
Figura 17: Porcentagem de animais que apresentaram perda do reflexo postural após administração crônica das drogas. Os camundongos receberam durante 21 dias água (n=11), bebida energética (BE, n=11), etanol (EtOH, n=9) ou etanol combinado com bebida energética (EtOH + BE, n=11) e foram testados uma vez por semana.
* Porcentagem maior do que do grupo controle (água) (p<0,01, exceto no teste D7 para o grupo EtOH em que p=0,05).
48 Como observado na Figura 18, quanto ao tempo de latência para perda do reflexo postural, a ANOVA de uma via detectou efeito significativo do fator grupo no teste agudo (F(3,37)=5,90; p<0,05). Após tratamento crônico, a ANOVA de duas vias detectou efeito significativo apenas do fator grupo (F(3,37)=13,70; p<0,001), mas não do tempo ou da interação entre os fatores.
O teste de Tukey indicou que os animais tratados com etanol, combinado ou não com a bebida energética apresentaram menor latência para a perda do reflexo postural quando comparados ao grupo controle (água) nos testes agudo e após 14 e 21 dias de tratamento (p<0,05).
0
Latência para a perda de reflexo postural após tratamento crônico
água BE EtOH EtOH+BE
Figura 18: Latência para perda do reflexo postural após a administração crônica das drogas. Os camundongos receberam durante 21 dias água (n=11), bebida energética (BE, n=11), etanol (EtOH, n=13) ou etanol combinado com bebida energética (EtOH + BE, n=12) e foram testados uma vez por semana.
* menor latência para a perda do reflexo postural do a do grupo controle (água) em todos os testes (p<0,05).
A Figura 19 mostra a duração média da perda do reflexo postural nos quatro grupos. A ANOVA de uma via detectou efeito significativo do fator grupo
49 no teste agudo (F(3,37)=3,36; p<0,05). Após tratamento crônico, a ANOVA de duas vias detectou efeito significativo apenas do fator grupo (F(3,37)=8,80;
p<0,05), mas não do tempo ou da interação entre os fatores. O teste de Tukey indicou que os animais tratados com etanol apresentaram maior duração de perda do reflexo postural quando comparado aos do grupo controle (água) nos testes após 7, 14 e 21 dias de tratamento (p<0,05), já os animais tratados com etanol combinado com bebida energética apresentaram maior duração da perda do reflexo postural quando comparados aos do grupo controle (água) nos testes agudo e após 14 e 21 dias de tratamento (p<0,05).
0
Duração da perda de reflexo postural após tratamento crônico
água BE EtOH EtOH+BE
Figura 19: Duração da perda do reflexo postural após a administração crônica das drogas. Os camundongos receberam durante 21 dias água (n=11), bebida energética (BE, n=11), etanol (EtOH, n=13) ou etanol combinado com bebida energética (EtOH + BE, n=12) e foram testados uma vez por semana.
* maior duração da perda do reflexo do que a do grupo controle (água) nos testes D7, D14 e D21 (p<0,05).
# maior duração da perda do reflexo do que a do grupo controle (água) nos testes agudo, D14 e D21 (p<0,05).
50 Em resumo, confirmamos que o etanol é uma droga capaz de causar a perda do reflexo postural dos camundongos dependendo da dose administrada. Porém, após tratamento crônico não foi observada nenhuma alteração (tolerância ou sensibilização) desse efeito provocado pelo etanol.
Além disso, a administração de bebida energética não alterou a perda do reflexo causada pelo etanol, tanto agudamente como após tratamento crônico.
Observamos que o grupo EtOH + BE apresentou menor número de mortes (1 em 12) do que o grupo EtOH (4 em 13), porém esta diferença não foi significativa (teste de Fischer, p=0,19).