Perfil eletroforético das frações da purificação

Figura 16: Perfil eletroforético da endoglicanase A recombinante em SDS prata. MM: Marcador de massa molecular

EB; 3 e 4: fração concentrada após ultrafiltração com membrana PM 50; 5 e 6: UF50; 7 e 8: G50. Gel B: 1: proteínas presentes no sobrenadante da levedura transformada com o vetor vazio (controle negativo); 2: G50; 3: UF50; 4: proteínas na fração concentrada pelo ultrafiltrador com membrana de 50 kDa e 5: EB. No gel B foram empregados 2 µ g de proteína total de cada amostra e no gel A estão indicadas as quantidades de proteína aplicadas em cada poço.

O perfil das proteínas das dive

concentrada e ultrafiltrada em membrana PM50 e a fração G50) obtidas nas etapas de purificação, foi analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE), conforme mostrado na figura 1

Em todas as frações analisadas é possível a identificação de uma proteína de aproximadamente 34 kDa (fig. 15), exceto na amostra correspondente às proteínas totais do controle negativo (fig. 15B, poço 1). Também é possível observar a presença de diferentes proteínas da hospedeira, sobretudo nos poços de 1 a 4 (fig. 15A), sendo que aquelas maiores que cerca de 70 kDa foram removidas após ultrafiltração em membrana PM50 (fig. 15B, poço 3). Nos poços 2 (fig. 15B), 7 e 8 (fig. 15A) foi analisado o perfil das proteíns da fração G50, onde podemos observar um maior grau de purificação da EGA recombinante, sendo que a maioria das proteínas presentes nas outras frações foram removidas.

(a)

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: Análise do perfil eletroforético da endoglicanase A recombinante e das frações da purificação

Perfil eletroforético da endoglicanase A recombinante em SDS-PAGE 12% (p/v) corado com prata. MM: Marcador de massa molecular Pageruller Prestained Protein Ladder (Fermentas); Gel A: 1 e 2: EB; 3 e 4: fração concentrada após ultrafiltração com membrana PM 50; 5 e 6: UF50; 7 e 8: G50. Gel B: 1: proteínas presentes no sobrenadante da levedura transformada com o vetor vazio (controle negativo); teínas na fração concentrada pelo ultrafiltrador com membrana de 50 kDa e 5: EB. No gel B foram empregados 2 µ g de proteína total de cada amostra e no gel A estão indicadas as quantidades de proteína aplicadas em cada poço.

O perfil das proteínas das diversas frações (extrato bruto, fração concentrada e ultrafiltrada em membrana PM50 e a fração G50) obtidas nas etapas de purificação, foi analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições

PAGE), conforme mostrado na figura 16.

Em todas as frações analisadas é possível a identificação de uma proteína de aproximadamente 34 kDa (fig. 15), exceto na amostra correspondente às proteínas totais do controle negativo (fig. 15B, poço 1). Também é possível observar a presença proteínas da hospedeira, sobretudo nos poços de 1 a 4 (fig. 15A), sendo que aquelas maiores que cerca de 70 kDa foram removidas após ultrafiltração em membrana PM50 (fig. 15B, poço 3). Nos poços 2 (fig. 15B), 7 e 8 (fig. 15A) foi oteíns da fração G50, onde podemos observar um maior grau de purificação da EGA recombinante, sendo que a maioria das proteínas presentes nas outras frações foram removidas.

(b)

: Análise do perfil eletroforético da endoglicanase A recombinante e

PAGE 12% (p/v) corado com (Fermentas); Gel A: 1 e 2: EB; 3 e 4: fração concentrada após ultrafiltração com membrana PM 50; 5 e 6: UF50; 7 e 8: G50. Gel B: 1: proteínas presentes no sobrenadante da levedura transformada com o vetor vazio (controle negativo); teínas na fração concentrada pelo ultrafiltrador com membrana de 50 kDa e 5: EB. No gel B foram empregados 2 µ g de proteína total de cada amostra e no gel A estão indicadas as

rsas frações (extrato bruto, fração concentrada e ultrafiltrada em membrana PM50 e a fração G50) obtidas nas etapas de purificação, foi analisado por eletroforese em gel de poliacrilamida em condições

Em todas as frações analisadas é possível a identificação de uma proteína de aproximadamente 34 kDa (fig. 15), exceto na amostra correspondente às proteínas totais do controle negativo (fig. 15B, poço 1). Também é possível observar a presença proteínas da hospedeira, sobretudo nos poços de 1 a 4 (fig. 15A), sendo que aquelas maiores que cerca de 70 kDa foram removidas após ultrafiltração em membrana PM50 (fig. 15B, poço 3). Nos poços 2 (fig. 15B), 7 e 8 (fig. 15A) foi oteíns da fração G50, onde podemos observar um maior grau de purificação da EGA recombinante, sendo que a maioria das proteínas presentes

D.2 Zimograma

Figura 17: Perfil eletroforético da endoglicanase A recombinante em SDS

azul brilhante de Comassie (a) e atividade em gel corado com vermelho do Congo (b). MM: Marcador de massa molecular (Fermentas); 1: 6,3 µ g das proteínas na fração G50; 2: 8 µ g das proteínas na fração UF50; 3: 32 µ g proteínas do extrato bruto (EB); 4: 23 µ g das proteínas do controle negativo (sobrenadante da levedura transformada com vetor vazio).

A realização do

entre a massa molecular da EG A recombinante com a atividade sobre CMC observada ao longo deste trabalho. Assim, após a eletroforese e tratamento do gel

(a) (b) 25 kDa 70 kDa 40 kDa 55 kDa 35 kDa 100 kDa 130 kDa 17 kDa 10 kDa 72

Perfil eletroforético da endoglicanase A recombinante em SDS-PAGE 12% (p/v) corado com (a) e atividade em gel corado com vermelho do Congo (b). MM: Marcador de (Fermentas); 1: 6,3 µ g das proteínas na fração G50; 2: 8 µ g das proteínas na fração UF50; 3: 32 µ g proteínas do extrato bruto (EB); 4: 23 µ g das proteínas do controle negativo (sobrenadante da levedura transformada com vetor vazio).

A realização do zimograma teve o objetivo de confirmar a correspondência entre a massa molecular da EG A recombinante com a atividade sobre CMC observada ao longo deste trabalho. Assim, após a eletroforese e tratamento do gel

PAGE 12% (p/v) corado com (a) e atividade em gel corado com vermelho do Congo (b). MM: Marcador de (Fermentas); 1: 6,3 µ g das proteínas na fração G50; 2: 8 µ g das proteínas na fração UF50; 3: 32 µ g proteínas do extrato bruto (EB); 4: 23 µ g das proteínas do controle negativo

zimograma teve o objetivo de confirmar a correspondência entre a massa molecular da EG A recombinante com a atividade sobre CMC observada ao longo deste trabalho. Assim, após a eletroforese e tratamento do gel

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para a renaturação das proteínas, este foi incubado em condições favoráveis à hidrólise do substrato. Para tanto, foi avaliado também o perfil eletroforético da amostra controle, relativa às proteínas da hospedeira transformada com o vetor vazio (fig. 16A, poço 4). Neste poço não foram observadas proteínas com massa molecular na faixa de 34 kDa. Isso confirma que a atividade hidrolítica em gel foi gerada pelas proteínas das amostras apresentando a proteína de massa molecular equivalente a 34 kDa, as quais são superponíveis aos halos de hidrólise observados na figura 16B.

Entretanto, na amostra relativa ao extrato bruto, também foi observado halo de hidrólise do substrato na faixa de 70 a 130 kDa aproximadamente, atividade esta provavelmente relacionada às proteínas da hospedeira (fig. 16B, poço 3). O mesmo foi observado no limite superior do gel para a amostra relativa ao controle negativo (fig. 16B, poço 4), na qual localizam-se proteínas de massa molecular maior que 130 kDa. Estas proteínas estão ausentes nas demais frações, podendo ser relacionadas possivelmente às proteínas da própria hospedeira, as quais podem ter atividade sobre CMC (Lynd et al., 2002).

O secretoma de P. pastoris conta com 38% de glicosidases que, embora sejam em parte originalmente proteínas ligadas à parede da levedura, podem soltar-se devido à reestruturação da parede celular (Mattanovich et al., 2009) e lise celular em função da interação com o metanol. Isso contamina a fração UF50 e, principalmente, o extrato bruto com outras proteínas, que não a EG Ar. Estas, caso tratem-se de uma

mistura de ß-1,3-glicanases, podem promover a degradação de CMC.

Parte E: Caracterização bioquímica da EG A recombinante

Para avaliar o efeito dos constituintes do meio de indução e das proteínas de massa molecular superiores a 50 kDa parcialmente removidas na ultrafiltração, foram caracterizadas funcionalmente as frações do extrato bruto (EB) e ultrafiltrado da membrana de 50 kDa (UF50) juntamente com a fração obtida após a cromatografia de gel filtração Sephadex G50 (G50).

E.1 Atividade enzimática da endoglicanase A em função da temperatura de